1.5.1 Matériel et réactifs
Tableau XI : Matériel spécifique à la culture de champignons.
Matériel Références Fournisseurs
Balance de précision BP211D Sartorius
Cellule de Malassez double, grille de 5 mm² 720.0149 VWR Centrifugeuse de paillasse réfrigérée 5804R Eppendorff Filtre seringue, membrane PES, 0,22 µm, 33 mm SLGP033RS Millipore Microtube, 2 mL, polypropylène, stérile 72.694.406 Sarstedt
Réservoir à réactif à fond en V 613.2671 Thermo Scientific Réservoir à réactif, 8 compartiments 613.2672 Thermo Scientific Seringue 10 mL, 3 pièces, stérile 302188 BD bioscience Microscope droit visible et fluorescence Axiscop Zeiss
Camera Axiocam Zeiss
Lecteur de microplaques Multiskan EX Thermo Scientific
PSMII PSM1200 Fisher
Microplaque 96 puits pour culture fonds en U 83.1835.300 Sarstedt
Tableau XII : Réactifs spécifique à la culture de champignons.
Réactifs Références Fournisseurs
Sabouraud bouillon 238230 Difco
Sabouraud gélosé 210950 Difco
Milieu RPMI 1640 51800-043 Invitrogen
DMSO BP231-100 Fisher
PBS
Amphotéricine B (250 µg/mL). A2942-50mL Sigma-Aldrich
Itraconazole (98 %) I6657-100mg Sigma-Aldrich
Bleu de trypan 15250-061 Gibco
Tween 20 P1379 Sigma-Aldrich
1.5.2 Détermination de la concentration minimum inhibitrice
Préparation des suspensions « fongiques » 1.5.2.1
Le milieu Sabouraud est le milieu habituellement utilisé pour la culture, l'isolement et l'identification des levures et des moisissures saprophytes ou pathogènes (Sautour et al., 2008) et même si le CLSI lui préfère le RPMI1640, il continue de proposer ce milieu pour les « sub’culture » dans sa section M44A ! (Mathur et al., 2011).
Le milieu RPMI 1640 est un milieu synthétique liquide sans bicarbonate contenant de la L-Glutamine et tamponné à pH 7,0 par le MOPS (acide N-morpholino-3-propane
sulfonique) et supplémenté avec du glucose jusqu'à une concentration finale de 2% (m/v).
Le RPMI 1640 modifié (sans bicarbonate) est le milieu de référence préconisé par le CLSI et l'EUCAST pour la détermination des CMI.
C’est pourquoi nous avons décidé de tester ces deux milieux de culture lors de la mise en place des tests d’activité antifongique au laboratoire.
1.5.2.1.1 Préparation de l'inoculum en milieu Sabouraud
1.5.2.1.1.1 Candida albicans
Candida albicans est mis en culture sur gélose Sabouraud puis incubé 24 h à 35°C. Une colonie du jour antérieur est ensemencée dans 5 mL de bouillon Sabouraud puis incubée 24 h à 35°C afin de former la suspension qui servira à l’inoculation.
Le mode opératoire est le suivant :
mise en culture de 5 mL de bouillon Sabouraud, incubation 24 h à 35°C,
coloration au bleu trypan et comptage en cellule de Malassez, ajustement de la suspension fongique entre 1 et 5 x 105 UFC/mL,
inoculation avec 50 µL par puit afin d’obtenir 0,5 à 2,5 x 105 UFC/mL final.
1.5.2.1.1.2 Aspergillus niger
Aspergillus niger est mis en culture sur gélose inclinée Sabouraud, jusqu'à sporulation (3 à 5 jours).
Le mode opératoire est le suivant :
récolte des spores avec 5 mL de Sabouraud liquide ou 5 mL d’eau, comptage des spores en cellule de Malassez,
ajustement de la suspension fongique entre 1 et 5 x 105 spores/mL,
1.5.2.1.2 Préparation de l’inoculum selon les recommandations de l’EUCAST
1.5.2.1.2.1 Candida albicans
Candida albicans est mis en culture sur gélose Sabouraud puis incubé 24 h à 35°C. Le jour de la manipulation le mode opératoire est le suivant :
prélever 5 colonies sur la gélose du jour précédent, disperser ces colonies dans 5 mL d'eau distillée,
colorer au bleu trypan et compter en cellule de Malassez,
diluer afin d'obtenir une suspension fongique entre 1 et 5 x 105 UFC/mL. inoculer avec 50 µL par puit afin d’obtenir 0,5 à 2,5 x 105 UFC/mL final.
1.5.2.1.2.2 Aspergillus niger
Aspergillus niger est mis en culture sur gélose inclinée Sabouraud, jusqu'à sporulation (3 à 5 jours).
Le jour de la manipulation :
récolter les spores avec 5 mL d’eau supplémentée avec du Tween 20 à 0,1 %, compter les spores en cellule de Malassez,
ajustement de la suspension fongique entre 1 et 5 x 105 spores/mL,
inoculation avec 50 µL par puit afin d’obtenir 0,5 à 2,5 x 105 spores/mL final.
Préparation des dilutions de drogues 1.5.2.2
Les différentes recommandations en termes d’étude des CMI sur des champignons laissent une grande liberté à l’expérimentateur. Il est ainsi possible de préparer les solutions de molécules à tester dans le milieu de culture utilisé, dans de l’eau, dans une solution saline comme le PBS et ceci en présence ou en absence de co-solvant comme par exemple du DMSO.
Nous avons ainsi voulu déterminer entre l’eau et le PBS quel était le meilleur solvant de préparation. Compte tenu de notre expérience en bactériologie, les milieux de culture ont été éliminés d’office. En effet leur forte charge en sels et leur pH tamponné sont deux facteurs des plus limitants quand les molécules à tester ont une hydrosolubilité limitée. Dans un deuxième temps, et suite à certaines observations lors de la
détermination des CMI, nous avons souhaité faire le point sur l’influence du PBS et du DMSO sur la croissance fongique dans les conditions opératoires.
Préparation de la solution d'amphotéricine B
A partir d'une solution commerciale stérile d'amphotéricine B à 250 µg/mL, on prépare une solution de travail à 8 µg/mL utilisant comme solvant le PBS ou l’eau afin d'obtenir une gamme de concentrations de 2 à 0,0075 µg/mL.
Préparation de la solution d'itraconazole
Une solution mère d'itraconazole est préparée à partir de la poudre commerciale à 98%, diluée en DMSO 0,5%. A partir de cette solution mère, une solution de travail à 64 µg/mL est obtenue en utilisant comme solvant de l'eau, et ce afin d'obtenir une gamme de concentrations de 16 à 0,06 µg/mL.
Préparation de la solution du DMSO
Le DMSO est préparé à 20% (v/v) en eau puis utilisé afin d'obtenir une gamme de concentrations de 5 à 0,019 %.
Préparation de la solution du PBS
Le PBS est préparé à une concentration 4 fois supérieure afin de pouvoir tester une gamme de concentrations de 50 à 0,39 % (v/v) dans les plaques.
Préparation des solutions d’AHPTs
Les solutions d’AHPTs ont été préparées en milieu Sabouraud. L’utilisation de DMSO comme co-solvant est nécessaire pour l’obtention des concentrations voulues (1024 µg/mL) en AHPTs. Ces concentrations sont très élevées par rapport au seuil de solubilité des AHPTs dans l’eau, mais ces valeurs ont été choisies de façon à se placer dans des concentrations similaires à celles proposées dans les recommandations et celles testées dans la littérature. Les gammes choisies de 256 à 1 µg/mL sont les mêmes que lors de la détermination de CMI avec les bactéries.
Dépôt des microplaques 1.5.2.3
La préparation des plaques est commune à chaque manipulation et identique à celle des tests bactériologiques (Figure 18 p. 77).
Distribution du milieu :
100 µL dans chacun des puits de la colonne 1. 150 µL dans chacun des puits de la colonne 2.
50 µL dans chacun des puits des colonnes 3 à 12. Distribution de la drogue à tester
50 µL dans chacun des puits de la colonne 2, puis après aspirations/refoulements, élimination de 100 µL, dans l'eau de javel.
50 µL dans chacun des puits de la colonne 4, puis réaliser les dilutions en reportant 50 µL dans les puits suivants après aspiration/refoulements, élimination des 50 µL de chacun des puits de la colonne 12 dans eau de javel.
Distribution de l’inoculum
50 µL dans chacun des puits des colonnes 3 puis 12 à 4.
la concentration finale de l’inoculum dans chacun des puits est 0,5 à 2,5 105 UFC/mL.
volume final de chaque puits: 100 µL.
De la façon identique au protocole de détermination d’activité antibactérienne, nous avons réservé 3 colonnes de puits à la réalisation de témoins :
colonne 1 : témoin milieu,
colonne 2 : témoin milieu + drogue, dans ce contrôle on peut observer les possibles interactions entre la drogue et le milieu utilisé,
colonne 3 : témoin milieu + fungi, ce contrôle permet de comparer la bonne croissance des microorganismes,
Les colonnes 4 à 12, contenant la gamme de concentrations à tester.
Lecture et interprétation des résultats
Les plaques ainsi ensemencées sont placées dans une étuve à 28°C ou 37°C pendant 24 ou 48 h La lecture se fait à 24 et 48 heures par turbidimétrie à 540 nm après agitation à 1020 rpm pendant 30 secondes dans un lecteur des microplaques.