3.7.1 Préparation des complexes
En milieu liquide 3.7.1.1
3.7.1.1.1 Co-précipitation
Cette méthode est la plus utilisée. Après dissolution de la CD dans de l’eau sous agitation, la molécule invitée est ajoutée. La concentration de la β-CD peut atteindre jusqu’à 20% (m/v) si l’invité tolère des températures élevées. Le précipité formé peut être collecté par décantation, centrifugation ou filtration. Le précipité peut être lavé avec un peu d’eau ou tout autre solvant miscible à l’eau tel que l’alcool éthylique, le méthanol et l’acétone. Le principal inconvénient de cette technique est lié au volume de liquide à utiliser. Du fait de la solubilité limitée de la CD en phase aqueuse, de grandes quantités d’eau sont nécessaires. La formation de complexe solide ou semi-solide peut être optimisée par l’utilisation d’additifs tels que l’éthanol, et pour les drogues basiques par l’adjonction d’ammonium. Les substances actives non ionisées forment des complexes avec les CD plus stables que leurs homologues ionisés. Selon la quantité d’eau utilisée pour former le complexe, on obtient un co-précipité, un « slurry » (pâte visqueuse) ou une pâte solide.
3.7.1.1.2 Extrusion
La CD, la molécule invitée et l’eau sont mélangés au fur et à mesure dans l’extrudeuse. Le degré de dispersion, la température de chauffe, la vitesse d’agitation et le temps peuvent être contrôlés dans la cuve de l’extruder. Selon la quantité d’eau initiale, le complexe extrudé peut sécher en refroidissant ou dans un four. Du fait de la température
générée, certaines molécules invitées labiles à la chaleur sont décomposées par cette méthode. Toutefois, cette technique présente l’intérêt d’être un processus continu et d’utiliser peu d’eau (Del Valle, 2004).
3.7.1.1.3 Séchage des complexes
Le séchage des complexes peut être effectué par plusieurs méthodes : par séchage dans un four, ou dans des dessiccateurs, en évitant de détruire le complexe, ou encore par lyophilisation (Asbahr et al., 2009).
En milieu solide 3.7.1.2
Certaines molécules invitées peuvent être complexées par simple mélange des deux poudres ensembles. Le temps de mélange nécessaire dépend de l’invité. Généralement, ce protocole est réalisé à température ambiante. Son principal avantage est de ne pas utiliser d’eau, sauf pour le rinçage, et ses inconvénients sont le risque de formation de croûtes des poudres, et l’obtention d’un mélange incomplet conduisant à une complexation insuffisante (Del Valle, 2004).
3.7.2 Caractérisation des complexes
Les analyses effectuées afin de mettre en évidence l’existence d’un complexe d’inclusion en solution se fondent sur les modifications des caractéristiques physico-chimiques de la substance complexée ou de la CD. Toute méthode capable de mettre en évidence un changement : de solubilité, de la rétention en chromatographie, de l’absorbance, des déplacements chimiques des protons en RMN, des accidents thermiques en thermo-analyse peut être utilisée. Ne seront développées ici que les méthodes utilisées dans ce travail à savoir la CLHP, la RMN et l’ACD.
En solution 3.7.2.1
3.7.2.1.1 Chromatographie Liquide à Haute Performance
La chromatographie liquide haute performance (CLHP), outre qu’elle soit une méthode d’analyse très sensible permettant de doser une quantité infime de molécules chimiques en solution, peut être utilisée pour la détermination de la constante de stabilité (Kc) des complexes (De Melo et al., 2008). En effet, Uekama et coll. ont observé que le temps de
rétention des acides et des bases faibles diminue significativement par addition d’α ou de β-CD dans la phase mobile (tampon phosphate), la phase stationnaire étant une phase échangeuse d’ions (Uekama et al., 1978). La mesure des temps de rétention, eux-mêmes directement proportionnels aux rapports de distribution des concentrations entre la phase stationnaire et la phase mobile, permet d’accéder à la valeur de Kc. S’appuyant sur cette observation, Loftsson et Brewster ont montré l’intérêt de la CLHP pour déterminer la valeur de la constante de stabilité des complexes de CD (Loftsson et Brewster, 1996). Dans ce but, la CD est introduite dans la phase mobile, à différentes concentrations, et la molécule étudiée constitue le soluté de l’échantillon injecté. Les valeurs du facteur de rétention, obtenues pour ce soluté, permettent alors de déterminer s’il y a formation d’un complexe, de déterminer la stœchiométrie du complexe formé ainsi que la valeur de la constante de stabilité de ce complexe (Bielejewska et al., 2002 ; De Melo et al., 2008 ; Moeder et al., 1996).
3.7.2.1.2 La Résonance Magnétique Nucléaire
La résonance magnétique nucléaire (RMN) permet de déterminer la structure tridimensionnelle de molécules organiques en solution. Cette technique est fondée sur l’absorption d’énergie par certains noyaux atomiques lorsqu’une molécule est placée dans un champ magnétique. Cette absorption se traduit par une rotation autour de l’axe nucléaire du noyau chargé ; ce spin nucléaire est à l’origine du signal RMN.
Les spectres de RMN sont indispensables pour affirmer l’inclusion d’une molécule dans une CD. Pour cela, il est possible de réaliser le spectre du proton (H1 RMN) qui renseigne sur la direction de pénétration de la molécule invitée dans la cavité de la CD par identification de la position de ses protons.
Lorsqu’il y a un complexe, les variations de la densité électronique autour de certains noyaux causent leur blindage ou déblindage par rapport au champ magnétique externe. Un déplacement de certains pics est observé : les pics des atomes d’hydrogène intervenant dans des liaisons faibles révèlent alors un phénomène de blindage ou déblindage selon qu’ils se déplacent respectivement vers des champs faibles ou des champs forts. Ainsi, les hydrogènes H3 et H5, situés à l’intérieur de la cavité, subissent un phénomène de déblindage lors de l’interaction avec la molécule invitée, uniquement lorsqu’il y a formation d’un complexe d’inclusion.
Cette méthode permet donc de visualiser les déplacements des bandes de résonance des protons internes de la CD (H3, H5) en cas d’inclusion d’une molécule, alors que les
protons externes restent peu affectés (H1, H2, H4, H6). De même sont étudiées toutes les modifications de bandes de résonance des protons de la molécule invitée afin de déterminer les atomes interagissant avec la CD.
En milieu solide 3.7.2.2
3.7.2.2.1 Méthode thermo-analytique : analyse calorimétrique différentielle (ACD) L’analyse calorimétrique différentielle permet d’observer des « accidents thermiques » (endo- ou exothermiques) caractéristiques d’un produit ou d’un mélange de produits en fonction de la température. Les spectres d’une molécule en calorimétrie différentielle présentent des accidents thermiques caractéristiques en fonction de la température représentant le passage vers différents états : état amorphe, état cristallin, état de fusion. Quand deux molécules s’associent pour former un complexe, on observe notamment un déplacement du point de fusion vers des températures supérieures pour la molécule invitée ou alors, sa disparition dans l’intervalle de température où la CD est décomposée. Toute modification structurale de la molécule invitée avant le début de la dégradation thermique et l’oxydation des CD peut être évaluée par ces techniques.