1.2.1 Matériel et réactifs
Le matériel nécessaire aux expérimentations biologiques est listé dans le Tableau VII, les réactifs dans le Tableau VIII.
Tableau VII : Matériel utilisé pour les expérimentations bactériennes.
Matériel Références Fournisseurs
PSMII Européenne Fluxfrance
PSMII TC120 Gelaire
Balance de précision (d=0,01mg de 0 à 10 g /
d=0,05mg de 10 à 100g) BP211D Sartorius
Centrifugeuse de paillasse réfrigérée 5804R Eppendorff
Incubateur Stabilitherme Thermo
Filtre seringue, membrane PES, 0,22 µm, 33 mm
type millex-GP SLGP033RS Millipore
Microplaque 96 puits pour culture fonds en U 83.1835.300 Sarstedt Microtube, 2 mL, polypropyléne, stérile, bouchon
vissé, fond conique à jupe
72.694.406 Sarstedt
Pipetboy accu 155015 Integra bio
sciences Réservoir à réactif à fond en V, capacité de 60 mL 613.2671 Thermo
Scientific Réservoir à réactif, 8 compartiments, 10 mL par
compartiment
613.2672 Thermo Scientific Seringue 10 mL, 3 pièces, stérile 302188 BD bioscience Seringue 20 mL, 3 pièces, stérile 300629 BD bioscience
Tableau VIII : Réactifs utilisés pour les expérimentations bactériennes.
Réactifs Références Fournisseurs
Mueller Hinton bouillon 275730 Difco
Mueller Hinton gélosé 225250 Difco
1.2.2 Détermination de la concentration minimale inhibitrice
La détermination de la concentration inhibitrice minimale (CMI) a été effectuée selon les recommandations du CA-SFM, de l’EUCAST et du CLSI.
L’activité antibactérienne des molécules (AHPTs, γ-CD et complexes), a été évaluée par la détermination de leur CMI, qui correspond à la plus faible concentration de substance inhibant toute croissance bactérienne. Pour réaliser ces déterminations, a été utilisée une technique dite en micro méthode en milieu liquide, en plaques 96 puits à fonds en U.
Cette méthode, dans ce contexte d’essais sur des molécules d’origine naturelle, a plusieurs aspects originaux :
elle se place dans un contexte d’étude avec une finalité thérapeutique, lié entre autre aux thématiques du laboratoire.
elle répond à un cadre méthodologique strict lié aux différentes recommandations des organismes de recommandations nationales, européens ou américains (CA-SFM, EUCAST et CLSI). Ainsi, même si cela lui permet de garder une certaine latitude dans la mise en place de conditions expérimentales, certains points ne peuvent être discutés. Dans la plupart des études antibactériennes, le milieu de culture utilisé varie sans justification (MH, BHI (Cunha et al., 2010), TS (Nyila et al., 2012), Columbia-Sang, Luria-Bertani (Gutierrez-Lugo et al., 2002 ; Watson, 2006)...). Dans le cadre méthodologique lié à ces organismes, le choix du milieu Mueller-Hinton (MH) est unanime. De la même façon, un bon nombre d’études font état de l’utilisation de souches bactériennes mal définies et/ou non adaptées à une thématique liée à la thérapeutique. Dans la plupart des cas, ce sont des souches isolées de l’environnement et dont l’identification et le profil de résistance aux antibiotiques ne sont pas toujours bien définis. Ici encore, nous avons souhaité nous inscrire dans le cadre méthodologique strict et nous avons utilisé des souches ATCC. Pour les souches résistantes, l’antibiogramme a été effectué sur Vitek® 2 (BioMérieux, France).
elle utilise des AHPTs commerciaux et non pas des AHPTs extraits de plantes, c'est-à-dire des molécules qui ne sont pas potentiellement contaminées par d’autres isoprénoïdes, triterpénoïdes ou d’autres molécules d’origine végétale et qui pourraient amener un biais sur les résultats biologiques.
Préparation des suspensions bactériennes 1.2.2.1
La souche bactérienne est ensemencée sur milieu MH gélosé et incubée 24 h à 35°C. À partir de cet ensemencement, une colonie bactérienne est reprise dans un bouillon MH et incubée 18-24 h à 35°C. Après centrifugation (10 min., 4500g), le culot bactérien est remis en suspension dans 1 mL d’eau distillée. Des dilutions appropriées (selon la souche bactérienne) en eau distillée stérile sont effectuées afin d’obtenir des suspensions contenant environ 2.105 Unités Formant Colonie par mL (UFC/mL). Les
facteurs de dilutions utilisés sont : 100 pour E.faecalis et E.faecium, 1000 pour S.aureus et P. aeruginosa et 6000 pour E.coli.
Préparation des dilutions de DMSO 1.2.2.2
L’utilisation de DMSO comme co-solvant est nécessaire pour l’obtention des concentrations voulues (1024 µg/mL) en AHPTs lorsqu’ils sont évalués seuls ou complexés. Ces concentrations sont très élevées par rapport au seuil de solubilité des AHPTs dans l’eau, mais ces valeurs ont été choisies de façon à se placer dans des concentrations similaires à celles proposées dans les recommandations et celles testées dans la littérature.
Après avoir testé ce co-solvant à des taux de 50% à 0,125% dans du MH nous avons montré que, utilisé en faible quantité, il n’a pas d’impact sur les cultures bactériennes. Le DMSO est aussi ajouté aux témoins de croissance bactérienne.
Préparation des dilutions de triterpènes seuls ou complexés 1.2.2.3
Les principes actifs sont testés à la concentration de 512 à 1 µg/mL. La solution de départ est préparée à une concentration de 1024 µg/mL. Afin d’obtenir une telle solution, et à titre d’exemple, cela revient à peser 6,14mg AHPT ou équivalent, de dissoudre cette masse avec 75 µL de DMSO et d’ajouter 5,92 mL de MH.
La solution est ensuite stérilisée par filtration sur une membrane 0,22 µm.
Préparation des microplaques 1.2.2.4
Figure 18 : Schéma de micro plaque pour la réalisation des CMI
La colonne 1 correspond à du milieu de culture seul. Ce témoin permet de confirmer la stérilité des opérations.
La colonne 2 contient du milieu MH et la substance à tester à sa plus forte concentration (habituellement 512 où 256 µg/mL). Ce témoin permet de mettre en évidence une interaction éventuelle entre un ou des composants du MH et la substance testée. Si l’absorbance est modifiée dans ce témoin, il faudra en tenir compte dans la détermination de la CMI.
La colonne 3 contient seulement du MH et l’inoculum et permet de vérifier que l’absence de croissance dans les autres colonnes n’est pas due à de mauvaises conditions de culture mais bien à une action de la substance testée sur les bactéries. Les colonnes 4 à 12 correspondent à des concentrations de la substance à tester de 512 à 2 µg/mL (où de 256 à 1µg/mL) suite à la réalisation d’une gamme de dilution d’ordre 2 et ce pour un volume final de 50 µL.
Il s’en suit l’ajout de la suspension bactérienne sous un volume de 50 µL dans les colonnes 3 à 12. Cela porte le volume réactionnel final à 100µL dans l’ensemble des puits et aboutit à tester une gamme de concentrations finales allant de 512 à 2 µg/mL (où de 256 à 1µg/mL).
Lecture et interprétation des résultats 1.2.2.5
Les résultats sont obtenus par lecture de la turbidité au spectrophotomètre à 540 nm après homogénéisation du contenu des puits grâce à un agitateur de microplaque.
Les données sont collectées à l’aide du logiciel Multiskan, puis exportées vers une feuille Excel pour traitement. Les CMI sont déterminées trois fois à partir de trois inocula indépendants.