1. Hébergement
Les souris utilisées lors de cette étude sont élevées en conditions environnementales contrôlées au sein d’une animalerie habilitée : la température ambiante est maintenue constante à 22°C et l’éclairage consiste en une alternance de périodes de lumière et d’obscurité de 12 heures. L’eau et la nourriture sont disponibles ad libitum. Elles sont nourries avec un régime d’entretien (Global diet, 2016, Harlan, Gannat, France), excepté les souris femelles gestantes et allaitantes (Global diet, 2018, Harlan, Gannat, France).
2. Modèles murins
Les expérimentations sont réalisées sur des souris de souches C57Bl/6 de quatre génotypes différents :
sauvages (wild type, WT) ;
sngpx4 -/-, invalidées pour l’isoforme spermatique nucléaire de GPx4 par insertion
homozygote de la séquence du gène EGFP (enhanced green fluorescent protein) dans l’exon alternatif Ea du gène gpx4 (figure 62A) (Conrad et al., 2005) ;
gpx5 -/-, invalidées pour la protéine GPx5 par délétion homozygote de l’exon 2 du
gène gpx5 (figure 62B) (Chabory, 2009 ; Chabory et al., 2009) ;
sngpx4;gpx5 -/-, appelées « double knock-out » (DKO), invalidées pour les protéines
snGPx4 et GPx5 par croisement des souris sngpx4 -/- et gpx5 -/-, jusqu’à l’obtention
de souris homozygotes pour les allèles invalidés des gènes gpx4 et gpx5.
Chaque expérimentation est réalisée simultanément sur une ou plusieurs souris sauvages et une ou plusieurs souris invalidées.
3. Génotypage
a. Extraction de l’ADN génomique
Lors de l’identification des animaux par un numéro, les doigts des souris sont coupés selon un code spécifique au laboratoire. L’ADN génomique des souris est extrait de ces doigts.
Les doigts sont incubés pendant une nuit à 55°C dans du tampon de lyse (Tris 100 mM pH 8,5, EDTA 5 mM, NaCl 200 mM, SDS 0,2 %, Protéinase K 0,08 mg/mL). Après une centrifugation de 10 minutes à 10 000g, un volume de surnageant est prélevé puis additionné de 2 volumes d’éthanol absolu. Une agitation par inversion permet de former un précipité d’ADN qui est culoté par une centrifugation de 10 minutes à 10 000g. Le surnageant est éliminé et l’ADN est séché à l’air libre. Il est ensuite solubilisé dans 100 µL d’eau bidistillée stérile exempte de nucléases, par une incubation d’une nuit à 4°C puis de 15 minutes à 55°C. Il peut alors être stocké à -20°C.
Gène
cible N° GenBank Séquence des amorces de 5’ en 3’ Taille (pb) Ta
gpx4 NC_000076.5 P1/ F – TCGGCGGCGCCTTGGCTACCGGCTC P2/ R – GGATCCGCCGCGCTGTCTGCAGCGTCCC P3/ R – TGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGG 119 342 60°C gpx5 NC_000079.5 P4/ F – GTGTCTGAGAATCTAGTCCTAGC P5/ R – GTGACAGTTTTCTCAGGGGTTGG P6/ R – CTGCCTTGTGAAGGTTGACAGG 263 1498/278 60°C
Tableau 6 : Les amorces utilisées pour le génotypage
Matériels & Méthodes
70
b. Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
Pour établir la présence homo- ou hétérozygote de l’allèle sauvage ou muté pour chacun des deux gènes chez chaque souris, des réactions de polymérisation en chaîne (PCR) indépendantes sont réalisées suivant le même protocole. L’ADN génomique (1 µL) est additionné de 2,5 mM de MgCl2, de 400 mM de dNTPs, de 400 nM de chacune des 2 amorces (forward/F et reverse/R ;
tableau 6 ; figure 62) et de 1,25 U de GoTaq Flexi DNA polymerase (Promega, USA) pour un volume final de 25 µL. Les réactions de polymérisation sont effectuées indépendamment dans un thermocycleur (Mastercycler personal, Eppendorf, Le Pecq, France).
L’analyse de la taille des produits de PCR est effectuée par l’électrophorèse de 10 µL d’échantillon sur gel d’agarose à 2 %, en présence de bromure d’éthidium (BET). Les résultats sont révélés sur un banc UV.
4. Manipulations
a. Test de fertilité
Le test de la fertilité des souris mâles est réalisé avec 6 mâles de chaque génotype, sauvage et DKO, et 2 femelles sauvages de même souche âgées de 3 mois pour chaque mâle. Le cycle sexuel des souris femelles est synchronisé. À cette fin, le mâle dont la fertilité doit être testée est laissé seul dans la cage pendant 72 heures puis retiré. Les 2 femelles attribuées au mâle sont placés seules dans la cage à sa place, où elles restent pendant 48 heures. Le mâle est ensuite ajouté avec les 2 femelles pour une durée de 7 jours. Par la suite, les 2 femelles sont placés dans des cages individuelles jusqu’à la fin du test.
Le délai de conception, le nombre de petits par portée et la mortalité périnatale sont mesurés. Le délai de conception correspond au nombre de jours entre la mise en présence des souris mâle et femelles et la naissance des souriceaux. Les mêmes mâles sont testés à différents âges.
b. Prélèvements
Les souris sont sacrifiées par dislocation cervicale. Tissus
Les tissus prélevés lors de la dissection (épididyme, testicule, foie…) sont immédiatement traités. Les tissus nécessaires à une future extraction de l’ARN ou des protéines sont placés dans des tubes stériles, congelés dans l’azote liquide, puis transférés à -80°C. Les tissus destinés à une inclusion en paraffine en vue d’une analyse histologique sont incubés dans du Carnoy (éthanol absolu 60 %, chloroforme 30 %, acide acétique 10 %) à température ambiante pendant 1 heure.
Spermatozoïdes
Les têtes et/ou les queues d’épididyme sont prélevés puis placées dans du milieu M2 (tableau 7 ; # M7167, embryo tested, Sigma-Aldrich) à température ambiante pour permettre la survie des spermatozoïdes. Les tissus sont dilacérés afin de libérer les gamètes dans le milieu M2, dans
Composants Concentration (g/L) Chlorure de calcium, 2 H2O 0,25137
Sulfate de magnésium anhydre 0,1649
Chlorure de potassium 0,35635
Phosphate de potassium monobasique 0,162
Bicarbonate de sodium 0,35
Chlorure de sodium 5,53193
Albumine, fraction V bovine 4,0
D-Glucose 1,0
HEPES, Na 5,42726
Rouge de phénol, Na 0,0106
Acide pyruvique, Na 0,0363
DL-Acide lactique, Na 2,95
Tableau 7 : La composition du milieu M2 (Sigma-Aldrich)
Processus Étape Durée
Déshydratation Éthanol 95° 1h Éthanol 100° 1h30 Éthanol 100° 2h30 Clarification Histo-Clear 2h Histo-Clear 2h Imprégnation Paraffine 1h Paraffine 1h30
Tableau 8 : Le programme de paraffinage des tissus
L’Histo-Clear (National diagnostics, USA) est un substituant du xylène. Il s’agit de D-limonène, distillé et purifié à partir d’oranges.
Matériels & Méthodes
71 lequel ils diffusent durant 10 minutes à 37°C. La concentration de la suspension de spermatozoïdes est déterminée par comptage sur cellule de Malassez.
Lorsque l’analyse des spermatozoïdes nécessite la réalisation d’un frotti sur lame, la suspension de spermatozoïdes est centrifugée à 300g pendant 5 minutes de façon à éliminer le milieu M2. Une fois le surnageant retiré, le culot de spermatozoïdes est lavé par un volume de PBS 1X, centrifugé à nouveau puis repris dans du PBS 1X. Un frotti de 60 000 spermatozoïdes/lame est réalisé à partir de cette suspension, sur des lames Superfrost®
(Menzel-Gläser, Allemagne). Les frottis sont séchés à l’air libre pendant 1 heure minimum avant tout traitement ou coloration. Chaque échantillon est analysé en triplicat, pour chaque paramètre.