I. La caractérisation phénotypique des souris sngpx4;gpx5 /
4. L’effet de la double invalidation sur la maturation de la chromatine spermatique
a. La structure de la chromatine
Étant donné la fragilité du noyau spermatique chez 25 % des spermatozoïdes de la tête d’épididyme et le rôle supposé de snGPx4 dans le pontage disulfure entre les protamines (Pfeifer
et al., 2001 ; Conrad et al., 2005), la condensation de la chromatine spermatique a été analysée par
diverses techniques, ainsi que le contenu en thiols libres des spermatozoïdes, chez des souris WT et DKO de 4 mois.
L’insertion de la chromomycine A3 et du bleu de toluidine
La condensation de la chromatine peut être analysée par l’utilisation de molécules capables de marquer l’ADN. Ainsi, le bleu de toluidine est un colorant, auquel sa charge positive et son caractère basique confère une forte affinité pour l’ADN, tandis que la chromomycine A3 (CMA3) est un fluorochrome qui s’intercale dans l’ADN et plus particulièrement dans les séquences riches en G et C. Dans les deux cas, plus la chromatine est condensée, moins les molécules peuvent interagir avec l’ADN.
Comme attendu, lorsqu’on compare les gamètes de la tête et la queue de l’épididyme, une diminution très significative de l’insertion de la CMA3 dans le noyau spermatique est observée chez les souris WT (26,97 ± 1,28 % vs 8,00 ± 1,54 %) comme chez les souris DKO (21,56 ± 2,42 % vs 5,79 ± 0,70 %) (figure 73). Ceci indique une augmentation de la condensation de la chromatine spermatique lors du transit épididymaire, ce qui est un fait établi (Krzanowska, 1982 ; Evenson et
al., 1986, 1989 ; Yossefi et al., 1994 ; Golan et al., 1996). Aucune différence n’est toutefois observée
entre les spermatozoïdes des souris WT et ceux des souris DKO, que ce soit dans la tête ou dans la queue de l’épididyme.
Cependant, la coloration des gamètes par le bleu de toluidine montre une augmentation importante de la proportion de spermatozoïdes colorés dans la tête de l’épididyme des souris DKO (67,66 ± 5,39 %) en comparaison des souris WT (11,85 ± 1,90 %) (figure 74). Cette différence n’est pas présente pour les spermatozoïdes de la queue de l’épididyme. La coloration du noyau spermatique par le bleu de toluidine confirme donc que la chromatine spermatique des spermatozoïdes de tête d’épididyme des souris DKO présente un défaut de condensation, qui semble corrigé lors du transit épididymaire puisque cette anomalie n’est pas retrouvée dans les gamètes de la queue de l’épididyme.
La différence de résultat obtenu entre le marquage par la CMA3 en cytométrie en flux et la coloration au bleu de toluidine provient probablement à nouveau du fait que les spermatozoïdes restent en suspension tout au long du protocole de cytométrie en flux, alors qu’ils sont soumis à un cycle de déshydratation/réhydratation lors de la réalisation de la coloration au bleu de toluidine. Ainsi, l’ensemble de ces résultats confirme la plus grande fragilité de la structure de la chromatine spermatique des spermatozoïdes de la tête de l’épididyme des souris DKO par rapport à ceux des souris WT, entraînant une décondensation de cette chromatine lorsqu’elle est soumise à un stress hydrique.
Figure 75 : L’observation de la chromatine des spermatozoïdes par MET
Des coupes de spermatozoïdes issus de la tête (a, b) et de la queue de l’épididyme (c, d, e, f) chez des souris WT (a, c, e) et DKO (b, d, f) sont observées par MET. Échelle : 500 nm. Grossissement : a-b, x26 800 ; c-d, x32 100 ; e-f, x104 000.
Résultats
L’observation du noyau spermatique par microscopie électronique à
transmission
Les défauts de condensation de la chromatine peuvent parfois être observés par microscopie électronique à transmission (MET). Dans ce cas, le noyau spermatique présente généralement des « lacunes » au sein de la structure très compacte de la chromatine (figure 30I-J). Les spermatozoïdes de la tête et de la queue de l’épididyme des souris WT et DKO ont donc été observés par MET (figure 75). Cette observation n’a pu mettre en évidence aucune modification visible de la structure générale de la chromatine spermatique chez les souris DKO par rapport aux souris WT. Le nombre et la taille des lacunes observables dans la chromatine sont variables entre les gamètes d’un même individu, mais de façon générale, ils ne sont pas modifiés entre les spermatozoïdes des souris WT et ceux des souris DKO.
Le contenu en groupements thiols libres
La fragilité de la chromatine des spermatozoïdes de la tête de l’épididyme des souris DKO face à un stress hydrique peut suggérer toutefois qu’il existe des différences au niveau moléculaire entre la chromatine spermatique des souris WT et DKO. Étant donné le rôle confié à snGPx4 dans le pontage disulfure entre les protamines lors de la condensation de la chromatine spermatique, le contenu en thiols libres des spermatozoïdes a été analysé par l’utilisation de monobromobimane (mBrB) en cytométrie en flux. Le mBrB réagit avec les thiols libres en émettant de la fluorescence. Ainsi, plus la fluorescence est intense, plus la quantité de thiols libres est importante.
Figure 76 : Le contenu en thiols libres des spermatozoïdes
Les spermatozoïdes de souris âgées de 4 mois sont incubés avec du monobromobimane (mBrB), qui fluoresce lorsqu’il réagit avec des thiols libres. Cette fluorescence est ensuite analysée par cytométrie en flux. n=5. * : p < 0,05 ; ** : p < 0,01.
Chez des animaux âgés de 4 mois, les résultats obtenus indiquent que les spermatozoïdes de la tête de l’épididyme des souris DKO contiennent significativement moins de thiols libres (11,23 ± 0,19 % de spermatozoïdes positifs au mBrB) que ceux des souris WT (20,62 ± 2,14 % de spermatozoïdes positifs au mBrB), ce qui sous-entend que le nombre de ponts disulfures dans ces spermatozoïdes est plus important (figure 76). Ce résultat est contraire à celui attendu. Dans la
Tête Queue
Gène Significativité Facteur Significativité Facteur
txn1 = * + 1,47 txn2 = = txnl1 ** + 1,26 = txndc2 (sptrx1) = = txndc3 (sptrx2) = = txndc8 (sptrx3) = = pdia3 (erp57) = * + 1,56 pdia4 (erp72) = = pdia5 p = 0,0556 + 1,28 * + 1,44 pdia6 (txndc7) ** + 1,36 p = 0,0556 + 1,15 pdia10 (txndc4) ** + 1,31 ** + 1,3 pdia11 (txndc1) = * + 1,22
Tableau 15 : L’expression des gènes codant des protéines à activité disulfide isomérase
La quantité d’ARNm produit par chaque gène a été déterminée par RT-Q-PCR, de façon relative à la quantité d’ARNm de la cyclophiline B. L’analyse a été réalisée à partir d’extraits d’ARNm de tissus de la tête et de la queue d’épididyme de souris âgées de 4 mois (n=5). Les différences significatives d’expression ou celles présentant une forte tendance entre les souris sauvages et DKO sont indiquées par la présence d’un symbole + ou – suivi par le facteur d’augmentation ou de diminution de l’expression, respectivement, chez les souris DKO par rapport aux souris WT. Un signe = indique une différence d’expression non significative. * : p < 0,05 ; ** : p < 0,01.
Figure 77 : La sensibilité des spermatozoïdes à des conditions réductrices
Les spermatozoïdes de la queue de l’épididyme sont incubés avec un tampon réducteur (PBS 1X, DTT 2 mM, Triton X-100 0,1 %) induisant une décondensation de la chromatine spermatique. Suite à une coloration de Shorr, le nombre de spermatozoïdes présentant une tête géante est compté. n=5. *** : p < 0,001.
Résultats
queue de l’épididyme, aucune différence significative n’est observée entre les souris WT et DKO. Cependant, il semble qu’il y ait tout de même une tendance à la diminution du contenu en thiols libres dans les spermatozoïdes des souris DKO par rapport aux souris WT (Mann-Whitney : p = 0,13 ; t test : p = 0,04).
b. L’expression épididymaire des gènes des protéines disulfide
isomérases
Afin de comprendre cette différence de contenu en thiols libres dans les spermatozoïdes des souris DKO par rapport aux souris WT, l’expression des gènes codant pour différentes enzymes à activité disulfide isomérase a été analysée dans la tête et la queue de l’épididyme des souris WT et DKO à 4 mois (tableau 15).
Les résultats indiquent que plusieurs de ces enzymes sont significativement plus exprimées chez les souris DKO que chez les souris WT, dès la tête de l’épididyme. Dans la tête de l’épididyme, ces gènes sont txnl1, pdia6 et pdia10. De plus, l’expression du gène pdia5 présente une tendance à l’augmentation chez les souris DKO par rapport aux souris WT. L’augmentation de leur expression est de 26 à 36 % selon les gènes. Dans la queue de l’épididyme, l’expression des gènes pdia3, pdia5,
pdia10 et pdia11 est significativement plus importante chez les souris DKO par rapport aux souris
WT et l’expression du gène pdia6 présente aussi une tendance à l’augmentation. L’augmentation de cette expression est plus forte que dans la tête puisqu’elle va de 22 à 56 %, avec 2 gènes montrant une augmentation de l’expression supérieure à 40 %. De plus, dans la queue de l’épididyme, l’expression du gène txn1 codant pour la Trx1 est significativement augmentée de 47 % chez les souris DKO par rapport aux souris WT. Or, Trx1 est impliquée dans la régénération du site actif des enzymes à activité disulfide isomérase.
Ces résultats semblent indiquer que l’épididyme tente de compenser l’absence de la protéine snGPx4, afin de maintenir l’activité de pontage disulfure dans les spermatozoïdes. Au vu de la diminution du contenu en thiols libres des spermatozoïdes DKO, il semble que la formation de ponts disulfures ne soit pas seulement maintenue mais qu’elle dépasse celle observée chez les souris WT.
c. La sensibilité des spermatozoïdes aux conditions réductrices
Lors des expérimentations précédentes, les spermatozoïdes de la queue d’épididyme des souris DKO n’ont montré aucune modification par rapport aux souris WT. Afin de s’assurer que l’absence de snGPx4 n’a pas modifié le pontage disulfure chez les gamètes des souris DKO, les spermatozoïdes de la queue de l’épididyme ont été soumis à un traitement réducteur (DTT 2 mM et Triton X-100 0,1 %), capable de réduire les ponts disulfures. Après une heure d’incubation, le traitement est éliminé et un frotti de spermatozoïdes est réalisé. Les gamètes sont ensuite observés au microscope optique, suite à une coloration de Shorr.
À 4 mois, chez les souris WT, comme sur les souris DKO, des spermatozoïdes présentent une tête géante similaire à celle observées dans la tête de l’épididyme après une coloration de Shorr (figure 71A). Ces spermatozoïdes sont comptés. Les résultats indiquent que le nombre des gamètes avec une tête géante après 1 heure de décondensation est doublé chez les souris DKO (64,31 ± 4,00 %) par rapport aux souris WT (28,70 ± 3,06 %) (figure 77). Les spermatozoïdes de
Figure 78 : L’évaluation de la peroxydation lipidique
Les produits de la peroxydation lipidique réagissant avec l’acide thiobarbiturique sont dosés par mesure de la fluorescence. Les résultats obtenus à partir des tissus de la tête et de la queue de l’épididyme, ainsi que des spermatozoïdes de la queue de l’épididyme sont exprimés en concentration relative de malondialdéhyde (MDA). n=3. * : p < 0,05.
Résultats
la queue de l’épididyme des souris DKO présentent donc une sensibilité plus importante à des conditions réductrices que les spermatozoïdes des souris WT.
Les spermatozoïdes des souris DKO présentent des défauts de condensation de la chromatine, en particulier dans la tête de l’épididyme. Les gamètes issus de la queue de l’épididyme, bien que non sensibles à un stress hydrique, sont tout de même sensibles à des conditions réductrices. Ces défauts ne sont pas associés à une diminution globale du pontage disulfure comme attendue en absence de snGPx4. Au contraire, le contenu en thiols libres dans les spermatozoïdes des souris DKO est significativement diminué, probablement grâce à l’augmentation de l’expression de plusieurs gènes codant pour des enzymes à activité disulfide isomérase.