1. Fractionnement de la chromatine spermatique
Lorsqu’elle est décondensée par du DTT, la chromatine des spermatozoïdes forme un halo de boucles d’ADN autour du noyau (figure 33). Ces boucles d’ADN qui sortent du noyau semblent principalement associées aux histones persistant après la mise en place des protamines (Zalenskaya
et al., 2000 ; Arpanahi et al., 2009). Pour séparer l’ADN lié aux histones de celui lié aux protamines,
ils génèrent donc une décondensation de l’ADN spermatique pour former ces halos, puis utilisent une endonucléase pour cliver ces boucles d’ADN hors du noyau qui sont alors solubles dans le tampon. Une simple centrifugation permet alors de séparer la fraction soluble de la fraction insoluble de la chromatine, respectivement liée aux nucléosomes et liée aux protamines (figure 65). Ce fractionnement de la chromatine spermatique a été réalisé d’après le protocole d’Arpanahi et al. (2009), lui-même modifié d’après Zalenskaya et al. (2000). Une suspension de spermatozoïdes en milieu M2 est centrifugée à 300g pendant 5 minutes, de façon à retirer le milieu. Les spermatozoïdes sont lavés dans un tampon Tris-HCl 50 mM, pH 8, puis ils sont incubés pendant 30 minutes à 4°C dans du tampon Tris-HCl 50 mM, pH 8, fluorure de phénylméthylsulfonyl (PMSF) 1 mM, bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB) 1 %, en vortexant de temps à autres, de façon à séparer le noyau du flagelle et des membranes. Cette suspension est centrifugée à 3 000g à 4°C pendant 10 minutes pour culoter les noyaux des spermatozoïdes, qui sont ensuite lavés à 2 reprises dans du tampon Tris-HCl 50 mM, pH 8 ; PMSF 1 mM. Les noyaux (108) sont incubés pendant 10 minutes à 4°C dans du tampon PBS 1X (sans
Mg2+, ni Ca2+), Triton X-100 0,5 %; PMSF1 mM pour les perméabiliser. Ils sont alors centrifugés
pour éliminer le tampon, puis ils sont repris dans le tampon de décondensation (PBS 1X PMSF 5 mM, DTT 10 mM) où ils sont incubés pendant 30 minutes à 37°C. La suspension de noyaux est ensuite additionnée de 3 mM de CaCl2 et de 5 U de nucléase micrococcale (MNase) et incubée
Matériels & Méthodes
pendant 3 minutes à 37°C. La digestion est immédiatement arrêtée par l’ajout de 20 mM d’acide éthylène glycol tétraacétique (EGTA). La suspension est fortement agitée à 37°C pendant 30 minutes pour libérer les boucles de chromatine clivées, puis elle est centrifugée à 5 000g pendant 10 minutes à 4°C. Le surnageant, constituant la fraction de chromatine soluble, est conservé à -20°C. Le culot est lavé dans du PBS 1X, PMSF 5 mM puis centrifugé à nouveau. Le culot, constituant la chromatine insoluble, est repris dans du PBS 1X et conservé à -20°C.
Une partie de ces 2 fractions est analysée sans traitement supplémentaire par immunodétection, afin de déterminer la présence ou l’absence des différentes protéines nucléaires basiques. La concentration totale en protéines est déterminée par un dosage de Bradford avec le kit Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad) selon une gamme étalon d’albumine bovine.
L’ADN présent dans le reste de ces fractions est extrait grâce à la méthode du phénol- chloroforme et purifié par précipitation en présence d’éthanol et d’acétate de sodium. L’ADN est ensuite repris dans du tampon TE (Tris 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM) et conservé à -20°C. L’ADN est dosé par utilisation de SYBR gold (Molecular probes, Invitrogen), un intercalant de l’ADN simple et double brin, dans un thermocycleur Mastercycler® ep realplex 2 (Eppendorf), selon une gamme étalon réalisée par dilution en cascade d’un échantillon d’ADN génomique de souris de concentration connue (Promega, USA). Les échantillons d’ADN sont alors analysés par un dot blot anti-8-OHdG pour déterminer la localisation des dommages oxydants.
2. Immunoprécipitation de l’ADN spermatique
Pour pouvoir déterminer les séquences d’ADN qui sont endommagées lors d’un stress oxydant, une immunoprécipitation de l’ADN spermatique a été réalisée en utilisant un anticorps dirigé contre la guanine oxydée. Cette immunoprécipitation a été effectué en parallèle sur les spermatozoïdes de souris sauvages, gpx5 -/- et sngpx4;gpx5 -/-, ainsi qu’avec un anticorps anti-5-
méthylcytosine, pour contrôler l’efficacité du protocole, et un anticorps aspécifique de même isotype, pour contrôler la spécificité de la précipitation de l’ADN.
a. Extraction, purification et fragmentation de l’ADN spermatique
La suspension de spermatozoïdes est centrifugée à 300g pendant 5 minutes pour éliminer le milieu M2. Le culot de spermatozoïdes est lavé en PBS 1X, puis incubé pendant une nuit à 55°C dans le tampon de lyse (Tris-HCl 25 mM, pH 8 ; SDS 1 % ; EDTA 5 mM ; DTT 0,1 mM ; Protéinase K 0,4 mg/mL). L’ADN du lysat est extrait par la méthode du phénol-chloroforme, puis purifié par une précipitation en présence d’éthanol et d’acétate de sodium. Le précipité d’ADN est solubilisé dans du tampon TE (Tris 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM) et traité pendant 20 minutes à 37°C avec de la RNase A à 20 µg/mL. La concentration et la qualité de l’ADN est mesurée avec le Nanodrop 1000 (Thermo Scientific). Cette concentration est alors ajustée à 100 ng/µL.Cet ADN spermatique est fragmenté par sonication à puissance maximale par cycles de 15 secondes « ON » & 30 secondes « OFF » à 4°C dans un sonicateur Bioruptor® Standard (Diagenode, Liège, Belgique). Après chaque sonication, la taille des fragments est vérifiée par dépôt de 1 µg d’ADN soniqué sur un gel d’agarose à 1 % en tampon TBE 1X (Tris-HCl 89 mM, pH 8,
DMR ciblée Méthylation Séquence des amorces de 5’ en 3’ Taille (pb) Ta (°C)
DMR H19 Paternelle F – AGGTTGGAACACTTGTGTTTCTGGAG R – TGGGCCACGATATATAGGAGTATGCT 159 61 DMR Rasgrf1 Paternelle F – CAGAGAGTATGTAAAGCCAGAGC R – CAGCAATAGCGGTAGCCACGGATG 188 61 DMR IG Paternelle F – CGCTATGAACTACCGCTACG R – CGGCATTAGTACACGGCGAACCTCC 136 61 DMR Kcnq1 Maternelle F – TCGGTCGAGTCCCAAGGTGAGT R – ACAGCTACCACATAACAACACG 184 61 DMR Igf2R Maternelle F – GAGTTTTCTTGTAGCCCAGAAATCTTCA R – TACGCGAGGTGAGGGTTCCACTGAT 127 61
Tableau 14 : Les amorces permettant l’analyse des DMR
pb : paire de bases ; DMR : région différentiellement méthylée ; Ta : température d’hybridation (Hiura et
Matériels & Méthodes
acide borique 89 mM, EDTA 20 mM). La sonication est répétée jusqu’à l’obtention de fragments dont la taille est comprise entre 200 et 600 paires de bases.
b. Immunoprécipitation de l’ADN
Chaque échantillon d’ADN analysé est immunoprécipité indépendamment par 3 anticorps différents :
Anticorps monoclonal de souris anti-8-OHdG IgG2a (15A3, Novus Biologicals) ; Anticorps monoclonal de souris aspécifique IgG2a (MOPC173, Abcam) ;
Anticorps monoclonal de souris anti-5-méthylcytosine IgG1 (33D3, Diagenode). Une immunoprécipitation est également effectuée en absence d’anticorps. Chacune de ces 4 immunoprécipitations est réalisée en triple sur 4 µg d’ADN fragmenté pour chaque génotype analysé.
L’ADN est dénaturé par une incubation à 95°C pendant 10 minutes puis conservé à 4°C, avant d’être dilué dans le tampon d’immunoprécipitation (tampon 1X : phosphate de sodium 10 mM, pH 7, NaCl 140 mM, Triton X-100 0,05 %). Un échantillon de 10 % est prélevé et conservé : il constituera le contrôle de l’efficacité de la précipitation (input). L’ADN est incubé en présence de 2,5 µg d’anticorps pendant une nuit à 4°C, sous agitation constante.
Des billes magnétiques couplées à des protéines chimériques A/G (# 88802, Thermo Scientific) sont prélavées à 2 reprises avec le tampon d’immunoprécipitation 1X. 5 µL de billes sont alors ajoutés au mélange d’ADN et d’anticorps et incubés pendant 4 heures à 4°C. Les billes sont lavées 4 fois dans du tampon d’immunoprécipitation 1X pendant 5 minutes à 4°C sous agitation. L’ADN fixé sur les billes est ensuite élué et purifié à l’aide du kit IPure (Diagenode, Liège, Belgique), le kit étant appliqué en parallèle aux billes et à l’input correspondant. L’ADN précipité obtenu est conservé à -20°C.
Le contrôle de l’enrichissement en séquences méthylées par l’anticorps anti-5- méthylcytosine a été réalisé par PCR en utilisant les amorces décrites par le tableau 14, selon le protocole décrit au paragraphe § I.3.b. La quantification a été effectuée à l’aide du logiciel ImageJ 1.47n (NIH, USA).
3. Dot blot
a. ADN
L’ADN purifié est déposé sur une membrane de nylon chargée positivement Amersham Hybond-N+ (GE Healthcare Life Sciences) préalablement hydratée avec du tampon TE, à l’aide d’un appareil de slot blot à vide (PR 648 slot blot, Hœfer). Chaque dépôt est à quantité égale d’ADN. Chaque puits de l’appareil est rincé par 500 µL de tampon TE. La membrane est alors séchée à l’air libre, puis l’ADN est hybridé de façon covalente à la membrane par une exposition de 1 minute aux UV. La membrane est réhydratée dans une solution saline de tampon Tris 1X (Tris-buffered
Matériels & Méthodes
82 1 heure à température ambiante dans du tampon de saturation (TBS 1X, 5 % lait), avant d’être lavée 2 fois pendant 5 minutes dans du TBS 1X, 0,5 % lait. La membrane est ensuite incubée pendant une nuit à 4°C en présence de l’anticorps primaire anti-8-OHdG dilué dans le TBS 1X, 0,5 % lait (tableau 12). La membrane est lavée 3 fois pendant 5 minutes dans le TBS 1X, 0,5 % lait, puis elle est incubée pendant 1 heure à température ambiante avec l’anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à une HRP dilué dans le TBS 1X, 0,5 % lait (tableau 12). La membrane est lavée pendant 5 minutes, une première fois dans le TBS 1X, 0,5 % lait, 2 fois dans le TBS 1X, 2 fois dans le TBS 1X, Tween 20 0,2 % et 2 fois dans le TBS 1X. La membrane est révélée grâce au kit SuperSignal West Femto Substrate (Pierce, Thermo Scientific) selon les instructions du fabricant et photographiée dans l’imageur MF-ChemiBIS 3.2 (DNR Bio-Imaging Systems Ltd.). L’analyse et la quantification du signal sont effectuées à l’aide du logiciel ImageJ 1.47n (NIH, USA).
b. Chromatine
Les différentes fractions de chromatines sont déposées manuellement sur une membrane de nitrocellulose (Porablot NCL, Macherey-Nagel) à quantité égale de protéines totales. La membrane est séchée à l’air libre. La membrane est réhydratée dans du TBS 1X, puis saturée pendant 1 heure à température ambiante dans du TBS 1X, 0,1 % Tween 20, 0,5 % lait. La membrane est ensuite incubée pendant une nuit à 4°C avec l’anticorps primaire dilué dans le tampon de saturation (tableau 12). Après 3 lavages de 10 minutes dans du TBS 1X, 0,1 % Tween 20, elle est incubée pendant 1 heure à température ambiante avec l’anticorps secondaire dilué dans le tampon de saturation (tableau 12). La membrane est lavée 3 fois pendant 10 minutes dans du TBS 1X, 0,1 % Tween 20, puis 1 fois pendant 10 minutes dans du TBS 1X. Le signal est révélé par électrochimiluminescence dans à l’aide d’un kit Western Lightning® Plus-ECL (Perkin Elmer) pour la protamine et TH2B et du kit SuperSignal West Femto Substrate (Pierce, Thermo Scientific) pour l’histone H3. Le signal émis est photographié dans l’imageur MF-ChemiBIS 3.2 (DNR Bio- Imaging Systems Ltd.). L’analyse et la quantification du signal sont effectuées à l’aide du logiciel ImageJ 1.47n (NIH, USA).