II. L’étude de la localisation des dommages oxydants au sein de
1. L’organisation de la chromatine spermatique épididymaire de souris et la
a. La distribution spatiale des différentes protéines nucléaires basiques
spermatiques murines
Avant de pouvoir analyser la localisation des dommages oxydants sur l’ADN spermatique, il a tout d’abord été nécessaire de comprendre comment cet ADN est organisé à l’intérieur du noyau des spermatozoïdes de souris. L’ADN spermatique chez les mammifères est agencé d’une façon tout à fait particulière, qui diffère de l’organisation classique d’un noyau d’une cellule somatique. En effet, lors de la spermatogénèse, les histones canoniques composant les nucléosomes ont tout d’abord été en partie remplacées par des variants d’histones, puis les nucléosomes d’histones canoniques et de variants ont été presqu’entièrement retirés et remplacés par des protamines (Prm). Ainsi, à la fin de la spermatogenèse, l’ADN spermatique murin est principalement associé aux protamines Prm1 et Prm2. Seule une petite part de l’ADN spermatique reste liée à des nucléosomes, contenant à la fois des histones canoniques et des variants d’histones spécifiques ou non des spermatozoïdes.
Certains travaux de recherche ont suggérés que les nucléosomes persistants ne seraient pas localisés de façon aléatoire le long de la séquence d’ADN (Arpanahi et al., 2009 ; Hammoud et al., 2009, 2011), ainsi que dans le volume du noyau (Li et al., 2008). Il a aussi été proposé que la structure de la chromatine spermatique et donc la localisation des nucléosomes soit probablement dépendante de l’espèce étudiée.
Figure 83 : La localisation des protéines nucléaires spermatiques
Des spermatozoïdes de souris WT ont été soumis à différentes détections immunofluorescentes afin de localiser la protamine 1 (Prm1), l’histone canonique H3, le variant H2B spécifique du testicule (TH2B) et la topoisomérase IIβ (TOPO IIβ), marqueur des MAR. Les résultats ont été analysés par microscopie confocale. Échelle : 10 µm.
Résultats
96 Pour évaluer l’organisation du noyau spermatique murin, la localisation de différentes protéines nucléaires a été analysée au sein des spermatozoïdes de la queue d’épididyme des souris WT par une approche immunologique. Un immunomarquage fluorescent, observé par microscopie confocale, a été réalisé sur des spermatozoïdes à l’ADN préalablement décondensé de façon partielle, à l’aide d’anticorps dirigés contre :
La protamine Prm1 ;
L’histone H3, qui est une des histones canoniques ;
L’histone TH2B, qui est un variant de H2B spécifique du testicule ;
La protéine TOPO IIβ, qui possède une activité endonucléase et qui est spécifiquement localisée au niveau des séquences de liaison à la matrice nucléaire (MAR).
Un contrôle négatif a été réalisé pour chaque marquage en réalisant le protocole sans utiliser l’anticorps primaire. Pour les 4 immunomarquages, aucun marquage aspécifique par l’anticorps secondaire n’a été observé (données non montrées).
La protéine nucléaire basique Prm1 est distribuée sur la totalité de l’espace du noyau, de façon homogène dans tous les noyaux spermatiques, ce qui n’est pas le cas des différentes histones (figure 83). En effet, l’histone H3 et le variant TH2B sont tous les deux localisés exclusivement sur la périphérie du noyau des spermatozoïdes, avec parfois un marquage très accentué à la base du noyau, c’est-à-dire dans la région dite de l’annulus nucléaire. Cependant, le marquage de H3 est de type ponctiforme avec certaines zones localisées de marquage très intense, tandis que le marquage de TH2B présente un aspect plus homogène sur toute la périphérie du noyau.
La protéine TOPO IIβ, qui est un marqueur des MAR où l’ADN est associé à la matrice nucléaire, est située également à la périphérie du noyau spermatique et en particulier sur une large région située à la base du noyau (figure 83) et correspondant probablement à la région où l’ADN est lié à l’annulus nucléaire (figure 34). Le marquage est relativement homogène, bien que des zones d’intensité plus forte soient souvent visibles à la base du noyau.
b. La localisation spatiale des dommages oxydants dans les
spermatozoïdes murins
Les dommages oxydants ont été analysés par la même technique employée que celle ayant permis de localiser les différentes protéines nucléaires spermatiques. L’anticorps employé se fixe spécifiquement aux bases 8-OHdG. L’immunomarquage est réalisé sur des spermatozoïdes de queue d’épididyme de souris WT et gpx5 -/-, ainsi que sur des spermatozoïdes de souris WT, traités
pendant 2 heures avec 7 mM d’H2O2. Un contrôle négatif du marquage a été réalisé sans anticorps
primaire. L’observation de ce contrôle négatif a révélé qu’il n’y a pas de fixation aspécifique de l’anticorps secondaire couplé à la sonde fluorescente. Ceci est confirmé par le fait qu’une partie des spermatozoïdes issus des souris WT et gpx5 -/- ne présentent absolument aucun marquage par
l’anticorps anti-8-OHdG, comme illustré sur les photographies correspondant au spermatozoïde de souris WT sur la figure 84A.
Figure 84 : La localisation des dommages oxydants dans le noyau spermatique
Des spermatozoïdes de souris WT et gpx5 -/- ont été soumis à une détection immunofluorescente afin de
localiser l’ADN oxydé in vivo, de même que des spermatozoïdes WT soumis à une incubation en H2O2
pour localiser les dommages oxydants subis in vitro (A). Un double marquage du 8-OHdG et de l’histone H3 (B) ou de la TOPO IIβ (C) a été réalisé. Les résultats ont été analysés par microscopie confocale. Échelle : 10 µm.
Figure 85 : Les effets de l’oxydation sur l’ADN
L’immunomarquage fluorescent des histones H3 et TH2B, observé par microscopie confocale, montre la présence de halos suite à la décondensation de l’ADN spermatique (A). Le co-marquage du 8-OHdG et de l’histone H3 sur un spermatozoïde présentant un halo d’ADN montre que la localisation des dommages oxydants reste intranucléaire (B). Le nombre de halos visibles grâce à l’immunomarquage de TH2B a été compté chez les souris WT et gpx5 -/- (C). n=5. ** ; p < 0,01.
Résultats
97 Les spermatozoïdes non traités issus des souris WT ne présentent pas tous une absence de marquage. Comme chez les spermatozoïdes issus des souris gpx5 -/-, plusieurs d’entre eux montrent
un marquage plus ou moins intense situé en périphérie du noyau. Ce marquage est généralement de type ponctiforme et est particulièrement intense dans une large région basale du noyau et dans la région subacrosomique. Il est identique au marquage observé sur les spermatozoïdes traités avec de l’H2O2 et issus de souris WT, qui servent de contrôle positif du marquage.
Pour avoir une meilleure idée de la localisation du 8-OHdG par rapport aux différentes protéines nucléaires spermatiques, des co-marquages du 8-OHdG et de l’une ou l’autre de ces protéines ont été réalisés. Ces co-marquages indiquent que les profils de marquage des histones H3 (figure 84B) et de la TOPO IIβ (figure 84C) sont très proches de celui du 8-OHdG et qu’ils sont au moins partiellement co-localisés. Ainsi, les dommages oxydants semblent principalement localisés dans des régions du noyau spermatique qui contiennent l’ADN lié à des histones et qui sont également situées proches des MAR.
Lors du marquage des histones H3 et TH2B, des spermatozoïdes présentant un halo autour du noyau ont pu être observés. Ce type de halo a déjà été décrit lors d’une décondensation importante de l’ADN spermatique et mis en évidence par un marquage au bromure d’éthidium (travaux de l’équipe du Dr. S. Ward, Hawaii, USA). Ce halo est généré par la sortie du noyau de boucles d’ADN de tailles variées. Durant le marquage des histones, ce halo peut se présenter de différentes façons. Il peut s’agir d’un marquage des histones sur l’ensemble de la surface occupée par les boucles (figure 85A, marquage de TH2B) ou d’un marquage uniquement localisé à l’extrémité des boucles d’ADN sortant de la membrane nucléaire (figure 85A-B, marquage de H3). Le marquage des histones canoniques et des variants peut alors également être uniquement localisé à l’extérieur des membranes nucléaires (figure 85A, marquage de TH2B) ou être à la fois à l’extérieur et à la périphérie du noyau (figure 85A-B, marquage de H3). Cette dernière différence est peut être due à l’intensité de la décondensation de la chromatine, qui est variable d’un spermatozoïde à l’autre, selon leur sensibilité au tampon de décondensation.
Le comptage des évènements de « halos » observés lors d’un marquage du variant TH2B montrent qu’ils sont beaucoup plus fréquents chez les souris gpx5 -/- (figure 85C). Ces résultats
indiquent une plus grande sensibilité des spermatozoïdes des souris gpx5 -/- aux conditions
réductrices, comme cela avait pu être observé chez les souris DKO. Ceci suggère que l’oxydation des noyaux des spermatozoïdes est à l’origine de leur sensibilité à des conditions réductrices.
De plus, il est important de noter que le co-marquage de l’histone H3 et du 8-OHdG montre qu’en présence d’un halo le marquage du 8-OHdG reste exclusivement et systématiquement situé à l’intérieur des membranes nucléaires, quelle que soit l’étendue du halo, et n’est donc pas présent sur les boucles à l’extérieur du noyau spermatique.
Ces derniers résultats ont été confirmés par une approche biochimique par fractionnement de la chromatine spermatique (figure 86). Brièvement, les noyaux des spermatozoïdes sont isolés puis soumis à une décondensation de la chromatine en présence de DTT et de Triton X-100. Cette décondensation provoque la formation de halos de boucle d’ADN autour des noyaux. Un clivage des boucles est réalisé à l’aide de l’enzyme MNase. Les boucles d’ADN se solubilisent dans le tampon de digestion, tandis que l’ADN toujours contenu dans les membranes nucléaires ne le peut
Figure 86 : L’analyse biochimique de la localisation des dommages oxydants par rapport à l’organisation de la chromatine spermatique
Le fractionnement de la chromatine des spermatozoïdes a été réalisé en clivant les boucles d’ADN obtenues lors de la décondensation de l’ADN. La fraction soluble (S) de la chromatine correspond aux boucles d’ADN sorties du noyau, tandis que la fraction insoluble (I) comprend l’ADN resté à l’intérieur du noyau. Une immunodétection de différentes nucléoprotéines (A1, Prm1 ; B1, TH2B ; C1 : H3) a été réalisé sur chaque fraction de chromatine. L’ADN de chaque fraction a été extrait et purifié, puis déposé en quantité égale sur une membrane avant de subir une immunodétection de la guanine oxydée (D1 : 8- OHdG). Le signal de chaque dot/slot blot est quantifié et présenté sur un histogramme (2).
Résultats
98 pas. Ainsi, les boucles d’ADN, formant la fraction soluble, sont séparées de l’ADN resté dans le noyau, insoluble, par centrifugation.
L’analyse des protéines nucléaires contenues dans les deux fractions d’ADN indique que Prm1 est présente à la fois dans les boucles et à l’intérieur du noyau (figure 86A) et que TH2B, bien que partiellement contenue dans le noyau, semble majoritairement présente dans les boucles à l’extérieur de l’ADN (figure 86B). Concernant H3, elle semble présente dans les deux fractions (figure 86C). Ces résultats sont en accord avec l’observation des profils de marquage des histones au niveau des spermatozoïdes présentant un halo d’ADN (figure 85A-B). Par ailleurs, l’analyse indique que des boucles d’ADN sont également libérées en absence de MNase, lors de l’étape de digestion. Ce résultat peut être expliqué par la présence et l’activation d’une endonucléase endogène au noyau spermatique durant l’ajout du CaCl2. La présence d’une telle enzyme endonucléase a déjà
été mise en évidence dans le noyau des spermatozoïdes de hamster, de souris et de l’homme (Sotolongo et al., 2003, 2005).
L’ADN contenu dans chaque fraction a ensuite été extrait et purifié avant d’être analysé par slot blot afin de détecter la présence de 8-OHdG. Les résultats montrent que, à quantité égale d’ADN déposé, la concentration en 8-OHdG est plus importante dans l’ADN resté prisonnier des membranes nucléaires que dans les boucles d’ADN du halo, chez les spermatozoïdes de souris WT comme de souris gpx5 -/- (figure 86D). La seule différence observable entre les spermatozoïdes des
deux différents génotypes vient du fait que la concentration en 8-OHdG est environ 5 fois plus forte dans l’ADN des spermatozoïdes des souris gpx5 -/- que dans celui des spermatozoïdes des
souris WT, ce qui confirme à nouveau la présence d’un stress oxydant chez les souris gpx5 -/-
(Chabory, 2009 ; Chabory et al., 2009).