I. La caractérisation phénotypique des souris sngpx4;gpx5 /
3. L’analyse des paramètres spermatiques
Les paramètres spermatiques généraux ont ensuite été évalués.
a. La numération des gamètes
Lors de l’analyse des spermatozoïdes épididymaires, les gamètes extraits des têtes et des queues d’épididyme ont été comptés en cellule de Malassez. Que ce soit à 4 ou à 8 mois, le nombre total de spermatozoïdes transportés dans la tête ou dans la queue de l’épididyme ne varie pas entre les souris WT et les souris DKO (figure 69).
Ce résultat, associé à l’absence de modification morphologique des tubules séminifères, semble indiquer une absence d’effet de l’invalidation de snGPx4 sur la spermatogenèse.
b. La morphologie des spermatozoïdes
Les observations généralesLa morphologie des spermatozoïdes de la tête et de la queue de l’épididyme a été évaluée à 4 mois à partir de frottis ayant subis une coloration de Shorr. Les gamètes présentant une pièce intermédiaire coudée (angle à 90°) ou en épingle à cheveux, ainsi que les spermatozoïdes présentant une tête géante ont été comptés.
En ce qui concerne le flagelle des spermatozoïdes, dans la tête de l’épididyme, aucun défaut n’est plus fréquent chez les souris DKO que chez les souris WT. Cependant, dans la queue de
Figure 71 : La morphologie de la tête des spermatozoïdes
Les spermatozoïdes issus de la tête et de la queue de l’épididyme de souris WT et DKO de 4 mois ont été colorés avec du colorant de Shorr (A), puis les gamètes présentant une tête « géante » (tête de flèche, ►) en comparaison aux gamètes normaux (flèche, →) ont été comptabilisés dans la tête de l’épididyme (B, n=5). Les spermatozoïdes de la tête de l’épididyme de souris WT et DKO sont observés par MEB (C, n=5), puis la tête de ces gamètes est mesurée. n=5. *** : p < 0,001.
Résultats
l’épididyme, une augmentation du nombre de spermatozoïdes possédant une pièce intermédiaire coudée a été observée chez les souris DKO (figure 70A). L’observation de ce type de gamète par microscopie électronique à balayage (MEB) a permis de déterminer que ce coude n’est pas associé à une rétention anormale de cytoplasme, mais probablement à un défaut de la structure interne de la pièce intermédiaire au niveau des mitochondries et/ou des microtubules (figure 70B).
Figure 70 : La morphologie du flagelle des spermatozoïdes
Les spermatozoïdes issus de la tête et de la queue de l’épididyme de souris WT et DKO de 4 mois ont été colorés avec du colorant de Shorr, puis la morphologie de la pièce intermédiaire a été observée afin de rechercher la fréquence de certaines caractéristiques, dont la présence d’un flagelle normal, celle d’un coude à 90° dans la pièce intermédiaire (B, observation par microscopie électronique à balayage) et celle d’un flagelle « en épingle à cheveux ». n=5. * : p < 0,05.
Néanmoins, le principal défaut des spermatozoïdes des souris DKO se situe au niveau de la tête spermatique. En effet, environ 25 % des spermatozoïdes dans la tête de l’épididyme présentent une tête géante sur les frottis colorés par la coloration de Shorr, alors qu’il n’y en a presqu’aucun chez les souris WT (figure 71A-B). Ce défaut avait déjà été observé dans les mêmes proportions chez les souris sngpx4-/-, lorsque les spermatozoïdes étaient soumis à un cycle de
séchage/réhydratation, ce qui est également le cas lors de la coloration de Shorr sur des frottis séchés à l’air libre (Conrad et al., 2005). L’observation par MEB des gamètes ne montre pas ce type de gonflement démesuré de la tête du spermatozoïde. Seuls quelques spermatozoïdes des souris DKO semblent présenter une légère augmentation de la taille de la tête (figure 71C). Les
Figure 72 : La morphologie du noyau et de l’acrosome des spermatozoïdes issus de la tête de l’épididyme des souris WT et DKO
Des sondes fluorescentes ont été utilisées pour visualiser le noyau (Hœchst 33342) et l’acrosome (lectine
peanut agglutinin [PNA] couplée à de l’Alexa488) de spermatozoïdes de la tête de l’épididyme de souris WT
Résultats
spermatozoïdes observés en MEB n’ayant pas subi de cycle de réhydratation, ceci sous-entend que ce phénotype de tête géante n’est pas une macrocéphalie présente in situ, mais un effet du stress subit par les spermatozoïdes lors du protocole de coloration. Il faut noter cependant que ces spermatozoïdes sensibles présentant une tête géante lors de la coloration de Shorr ne sont pas retrouvés dans la queue de l’épididyme.
L’absence de snGPx4 et GPx5 a donc un effet sur la morphologie du flagelle des spermatozoïdes. Les spermatozoïdes à tête géante observés en coloration de Shorr chez les souris
sngpx4-/- et DKO ne sont pas des spermatozoïdes macrocéphales, mais démontrent une plus grande
susceptibilité des gamètes face à un stress hydrique. Cependant, cette fragilité semble corrigée lors de la maturation épididymaire puisqu’elle n’est pas observée pour les spermatozoïdes de la queue de l’épididyme des souris DKO.
L’analyse par fluorescence des différents compartiments de la tête des
spermatozoïdes
Afin de connaître les compartiments de la tête spermatique touchés par cette augmentation de volume lors d’une réhydratation, des frottis de spermatozoïdes issus de la tête de l’épididyme des souris DKO ont été marqués par deux sondes fluorescentes. La première est le Hœchst 33342, un intercalant de l’ADN, qui permet de visualiser le noyau. La deuxième sonde est de l’Alexa488 couplé à du PNA (peanut agglutinin), une lectine qui est capable de se fixer sur la membrane externe de l’acrosome et permet donc de s’assurer de la présence et de la forme de l’acrosome.
L’observation de ces spermatozoïdes à tête géante marqués par ces sondes a permis de se rendre compte que seul le noyau du gamète est responsable de l’augmentation de volume (figure 72). L’acrosome de ces spermatozoïdes est non seulement toujours présent mais garde une forme et une taille quasi normales. Selon les spermatozoïdes à tête géante et la façon dont le noyau s’est étendu, l’acrosome est soulevé ou poussé sur le côté (figure 72). Le marquage de l’ADN et de l’acrosome couvrant la totalité de la surface de la tête spermatique, il semble que le compartiment cytoplasmique n’augmente pas de volume lors de la réhydratation.
L’absence de snGPx4 dans le noyau des spermatozoïdes provoque donc une fragilité du noyau spermatique, alors plus prompt à se décondenser. Cette expansion de l’ADN spermatique semble ainsi suggérer un défaut de structuration de la chromatine spermatique.
Les paramètres spermatiques des souris DKO sont peu modifiés. En effet, le nombre de spermatozoïdes en transit dans l’épididyme est identique à celui des souris WT. Une augmentation du nombre de spermatozoïdes présentant un angle dans la pièce intermédiaire du flagelle a été observée chez les souris DKO. De plus, dans la tête de l’épididyme, la présence de spermatozoïdes avec une tête géante a été relevée après un cycle de déshydratation/réhydratation. Cette augmentation de la taille de la tête des spermatozoïdes, qui n’est pas observée dans la queue de l’épididyme, est associée à une augmentation de la taille du noyau, probablement en lien avec un défaut de condensation de la chromatine spermatique.
Figure 73 : L’évaluation de la condensation de la chromatine spermatique par cytométrie en flux
Les spermatozoïdes épididymaires de souris WT et DKO âgées de 4 mois sont marqués par la chromomycine A3, un intercalant de l’ADN, puis analysés par cytométrie en flux, afin de mesurer la condensation de la chromatine. n=5. ** : p < 0,01.
Figure 74 : L’évaluation de la condensation de la chromatine spermatique par coloration sur frotti
Les spermatozoïdes épididymaires de souris WT et DKO de 4 mois sont colorés au bleu de toluidine. Les spermatozoïdes non ou peu colorés possèdent un ADN condensé (flèche, →), alors que ceux colorés possèdent un ADN peu condensé (tête de flèche, ►) (A, échelle : 5 µm). Les spermatozoïdes peu condensés ont été comptés dans la tête (B) et dans la queue de l’épididyme (C). n=5. *** : p < 0,001.
Résultats