II. L’étude de la localisation des dommages oxydants au sein de
2. La localisation chromosomique des dommages oxydants
Après avoir analysé la localisation des dommages oxydants en fonction de la structure de la chromatine spermatique, une approche globale permettant de déterminer quelles régions du génome sont plus sensibles à l’oxydation a été mise en place. Il s’agit de réaliser une immunoprécipitation de l’ADN oxydé à partir d’ADN spermatique murin purifié et fragmenté, suivie d’un séquençage à haut débit des fragments d’ADN oxydés précipités. Cette immunoprécipitation a été conduite sur les souris WT, gpx5 -/- et DKO.
Le protocole utilisé a été mis au point à partir d’un protocole d’immunoprécipitation de l’ADN méthylé (meDIP). La différence vient du fait que l’anticorps employé est dirigé non pas contre le 5-méthylcytosine (5-meC) mais contre les bases 8-OHdG. De façon à s’assurer de l’efficacité du protocole et de la fiabilité du matériel (billes magnétiques couplées à des protéines chimériques A/G, kit d’élution et purification de l’ADN…), l’immunoprécipitation a été réalisée en parallèle avec l’anticorps anti-8-OHdG et un anticorps anti–5-meC dont le clone est connu pour son efficacité lors de protocoles de meDIP. En guise de contrôle négatif, l’immunoprécipitation a également été réalisée en présence d’un isotype contrôle aspécifique, ainsi qu’en absence d’anticorps.
Figure 87 : Le contrôle de l’efficacité de la sonication et de la taille des fragments d’ADN
L’ADN spermatique extrait est purifié et soniqué afin de le fragmenter. La taille des fragments d’ADN est analysée par électrophorèse, en présence de bromure d’éthidium.
Figure 88 : Le contrôle de l’efficacité de l’immunoprécipitation
Le protocole d’immunoprécipitation de l’ADN spermatique a été réalisé avec un anticorps dirigé contre le 8-OHdG, mais également avec un anticorps anti-5-méthylcytosine, connu pour son efficacité dans ce type de protocole. La vérification de la validité du protocole a été effectuée en réalisant des PCR sur les échantillons d’ADN précipités, afin de vérifier l’enrichissement en ADN méthylé, suite à l’utilisation de l’anticorps anti-5-meC. La quantité des séquences d’ADN cibles dans les échantillons précipités est rapportée à celle dans l’ADN de départ (input). Un rapport inférieur à 1 indique une déplétion en cette séquence cible, tandis qu’un rapport supérieur à 1 indique un enrichissement.
Résultats
99 Après l’extraction et la purification de l’ADN spermatique murin provenant de souris WT,
gpx5 -/- et DKO, une sonication permet de fragmenter les brins d’ADN. La taille moyenne des
fragments est analysée par une électrophorèse en gel d’agarose. Lors de la réalisation finale du protocole, la taille des fragments obtenus était comprise entre 800 et 300 pb, avec une majeure partie des fragments mesurant environ 500 pb (figure 87). Cette analyse des fragments a également permis de s’assurer de l’absence d’ARN dans les échantillons d’ADN, suite au traitement par la RNAse A.
Après la réalisation de l’immunoprécipitation et la purification de l’ADN oxydé, les fragments d’ADN obtenus ont été amplifiés, clonés puis séquencés par la technique du « paired-end
sequencing » par le laboratoire du Pr. Stephen A. Krawetz (Wayne State University, School of
Medicine, Detroit, USA). L’analyse des résultats du séquençage est actuellement en cours.
Les fragments obtenus ont également été analysés par PCR afin de déterminer si le protocole d’immunoprécipitation a été efficace. Pour cela, ne connaissant pas les régions oxydées du génome, c’est l’enrichissement en séquences méthylées par l’anticorps anti–5-meC qui a été vérifié. Des PCR ont été réalisées en utilisant des amorces permettant d’amplifier les séquences différentiellement méthylées entre les génomes d’origine paternelle et maternelle (DMR), qui sont connues pour réguler certains gènes dits « soumis à l’empreinte parentale ». Ayant effectué l’immunoprécipitation sur de l’ADN spermatique, seuls les fragments d’ADN correspondant aux DMR paternellement méthylées doivent avoir été enrichis dans l’ADN précipité par l’anticorps anti–5-meC par rapport à l’ADN total de départ (input).
Les résultats de ces PCR indiquent que les séquences des DMR ne sont pas détectables dans les échantillons précipités avec l’anticorps aspécifique et que, sans anticorps, ces séquences sont très peu précipitées (figure 88). Ceci signifie que les billes servant à précipiter le couple anticorps/ADN ne peuvent fixer que très peu d’ADN de façon aspécifique et qu’elles n’en fixent pas du tout si elles sont couvertes d’anticorps. L’ADN précipité avec l’anticorps anti–5-meC présente un fort enrichissement en séquences DMR paternellement méthylées (loci H19, Rasgrf1 et IG) par rapport à l’ADN de l’input et un appauvrissement en séquences DMR maternellement méthylées (loci Kcnq1 et Igf2R) (figure 88). Le fait que des séquences DMR maternellement méthylées soient détectables dans l’ADN spermatique précipité par meDIP peut être dû à la présence de spermatozoïdes présentant des défauts dans leur profil de méthylation ou/et à une légère contamination par des cellules immunitaires ou épididymaires. Concernant l’ADN précipité par l’anticorps anti–8-OHdG, la plupart des échantillons obtenus sont appauvris en séquences DMR, bien que les DMR de Kcnq1 et Rsgrf1 soient présentes dans les mêmes proportions que dans l’ADN de l’input dans les échantillons WT et gpx5 -/- (figure 88), ce qui pourrait indiquer que
Résultats
L’analyse de la localisation des dommages oxydant sur l’ADN spermatique a permis de montrer que ces dommages ne sont pas localisés de façon aléatoire. D’un point de vue spatial, les bases 8-OHdG sont retrouvées dans la périphérie du noyau spermatique et surtout dans une large région située à la base du noyau. Ces régions correspondent à celles enrichies en nucléosomes, qu’ils soient composés d’histones canoniques ou de variants, et correspondent également à la localisation de TOPO IIβ qui est un marqueur des MAR. Les spermatozoïdes oxydés ont une plus forte tendance à former des halos de boucles d’ADN sortant des membranes nucléaires lorsqu’ils sont soumis à un milieu réducteur et, dans ces noyaux formant un halo d’ADN, l’ADN ayant été oxydé reste piégé à l’intérieur des membranes nucléaires, suggérant ainsi que les régions d’ADN liées aux histones et associées à la matrice nucléaires sont préférentiellement concernées par l’oxydation.