Le temps d’implantation

Le temps d’implantation a aussi une forte influence sur la réponse obtenue. Après une phase d’initiation plus ou moins longue, une croissance osseuse est observée au sein du matériau lors de son implantation en site ectopique. S’en suit un ralentissement de la formation osseuse puis à terme une résorption de l’os néoformé en raison de l’absence de contraintes mécaniques qui assurent le remodelage et le maintien du capital osseux. Pour comparer le potentiel ostéoinducteur d’un matériau, il est donc conseillé d’étudier la quantité d’os formé à l’issue de temps d’implantation différents. Chez les grands animaux, les durées d’implantations classiquement étudiées sont 6 et 12 semaines. La durée de 6 semaines correspond à un temps précoce qui donne des informations sur la cinétique de croissance, alors que le temps de 12 semaines, pour lequel la formation osseuse est bien établie, permet d’effectuer une comparaison fiable du potentiel ostéoinducteur des échantillons. Une comparaison à plus long terme est aussi parfois effectuée.

Yuan et al. ont réalisé une cinétique détaillée des phénomènes reliés à l’ostéoinduction par des céramiques de BCP (HA/β-TCP : 62/38) après implantation intramusculaire chez le chien.

Après 7 jours d’implantation, ils ont observé une infiltration de fibres et de cellules sanguines dans les pores du matériau ; après 14 jours, des cellules ont adhéré à la surface des pores et la présence de vaisseaux sanguins est détectée. La prolifération et la différenciation ostéoblastique débutent à J21 et à J30. La matrice osseuse (tissu ostéoïde et ostéoblastes) apparaît se minéraliser après 45 jours d’implantation. A J60, un début de remodelage osseux est visible mais la maturation de l’os formé se poursuit : après 6 mois d’implantation, la présence de moelle osseuse est clairement distinguée au centre des pores et après 1 an, l’os apparaît mature avec présence de canaux haversiens (Yuan et al. 2006a).

2. Objectifs

L’objectif de cette étude était de confirmer la biocompatibilité et d’évaluer le potentiel ostéoinducteur des biomatériaux réalisés et caractérisés au cours de ce travail. Pour cela, des implantations intramusculaires de nos céramiques ont été effectuées chez des brebis. Le modèle animal ovin apparaissait parfaitement adapté pour cette étude étant donné que cettre dernière avait deux finalités : 1) comparer l’effet de notre revêtement sur l’ostéoinduction induite par la rhBMP-2 associée au matériau par deux méthodes distinctes et 2) évaluer le potentiel ostéoinducteur intrinsèque du revêtement nanocristallin. Afin tout d’abord d’effectuer une comparaison des différents échantillons contenant la protéine et de leur efficacité potentielle en application clinique, il semblait nécessaire d’utiliser un modèle animal dont les capacités d’ostéogénèse en réponse à la BMP-2 apparaissaient proches de celles de l’homme. C’est le cas du modèle animal ovin : celui-ci est sensible à l’action de la rhBMP-2 (Kirker-Head et al. 1998) mais la protéine doit être administrée en quantité importante pour être efficace (Toth et al. 2009). Le modèle animal ovin posséde, en outre, la capacité d’induire une formation d’os dans un site ectopique en réponse à certains matériaux phosphocalciques (Le Nihouannen et al. 2005), ce qui nous a permis d’évaluer le potentiel ostéoinducteur intrinsèque de notre revêtement.

Différents types d’échantillons ont été implantés : des céramiques de BCP témoins et revêtues seules ou en présence de rhBMP-2. La BMP-2 a été associée aux matériaux par deux méthodes distinctes : la méthode de dépôt d’une goutte concentrée de solution protéique puis séchage, ou la méthode d’adsorption. Après 1 et 3 mois d’implantation, des observations histologiques ont été réalisées sur des coupes non-minéralisées des prélèvements et une analyse quantitative de l’os néoformé a été effectuée.

3. Matériel et méthodes

3.1. Implants

3.1.1. Les céramiques

Les implants de BCP (CERAFORM - HA/β-TCP : 65/35) fournis par la société Teknimed sont des parallélépipèdes de 5 mm x 5 mm x 20 mm (implantation A) ou des cylindres de 6 mm de diamètre et 20 mm de long (implantation B). Ces implants ont été coupés en deux dans la largeur pour obtenir des échantillons longs de 9 à 10 mm (Figure V.1). Après la découpe, les échantillons ont été calcinés à 900°C pendant 5 minutes puis une partie a été revêtue avec le procédé NanoAp-EtOH. Les céramiques ont ensuite été stérilisées par rayonnement gamma avant utilisation.

Figure V.1 : Photographie des échantillons placés dans les muscles paravertébraux des brebis lors de l’implantation A (a) et de l’implantation B (b).

3.1.2. Association avec la rhBMP-2

Une partie de ces échantillons a été utilisée en association avec la rhBMP-2. L’association de la protéine a été réalisée par dépôt de solution concentrée ou par adsorption sur les implants en conditions stériles (utilisation de solutions et matériels stériles sous hôte à flux laminaire).

• Dépôt d’une solution de rhBMP-2 sur les échantillons (implantation A) Une solution de rhBMP-2 à 3 mg/ml dans de l’eau milliQ est préparée. 50 µl de cette solution sont déposés à l’aide d’une micropipette sur l’échantillon parallélépipédique en effectuant 5 dépôts de 10 µl en différents points le long de la céramique. De ce fait, la solution pénètre à l’intérieur de la majorité des pores de la céramique sans traverser cette dernière. La quantité de protéine déposée est alors parfaitement contrôlée. La solution protéique sèche pendant 24h

à température ambiante sous une hôte à flux laminaire et les échantillons sont ensuite conservés à 4°C pendant 48h avant leur implantation.

La quantité de BMP-2 déposée est de 150 µg/ échantillon (600µg/cm3) quel que soit le type de céramiques considérées (témoins ou revêtues).

• Adsorption de rhBMP-2 sur les échantillons (implantation B)

Les cylindres sont immergés dans 550 µl de solution à 300 µg/ml de protéines dans un tampon NaCl 1M, TRIS 25 mM, CaCl2 10mM, pH 7,4 pendant 24h à 37°C. La quantité

initiale de protéine mise en contact correspond à 600 µg/cm3 d’échantillon. La solution d’adsorption est ensuite retirée et les échantillons sont lavés à deux reprises pendant une minute dans de l’eau ultrapure (Gibco). Les échantillons sont séchés pendant 24h à température ambiante, conservés à 4°C pendant 48h puis implantés. La quantité de protéine restant en solution est déterminée par la méthode de Bradford (Biorad assay) dans des microplaques.

La quantité de BMP-2 adsorbée est respectivement de 68 ± 14 µg/échantillon et 138 ± 10 µg/échantillon pour les cylindres témoins et revêtus.