Etude histologique

L’inclusion des implants et la découpe des blocs obtenus ont été effectués en collaboration avec le laboratoire d’anatomie et cytologie pathologique de l’hôpital de Rangueil.

• Inclusion des échantillons

L’étude histologique a été réalisée sur coupes non-déminéralisées. Pour cela, les échantillons, conservés dans la solution de formol, sont déshydratés puis inclus dans une résine de méthyl- méthacrylate. Deux techniques d’inclusion ont été réalisées. Les échantillons extraits après 1 mois d’implantation ont été inclus par la méthode utilisée classiquement au laboratoire. Cette méthode comporte la fixation des échantillons dans de l’alcool à 80°C pendant 24h puis leur déshydratation par immersion dans des bains successif d’alcool de concentration croissante pendant 24h puis dans du xylène pur pendant 4h. Les prélèvements sont ensuite placés dans différents bains de méthyl-méthacrylate à température ambiante puis la dernière solution est placée à 35°C jusqu’à polymérisation complète de la résine.

En raison de la forte toxicité des solutions employées et du nombre important d’échantillons à traiter, un kit d’inclusion (Kit historésine Leica) a ensuite été utilisé pour l’inclusion des autres échantillons. L’inclusion a été réalisée selon les instructions du fabricant : après déshydration des échantillons par immersion dans des bains successifs d’alcool, les prélèvements sont inclus dans une résine de méthyl-méthacrylate et placés dans une étuve à 30°C pendant 2 heures.

• Réalisation des coupes

Des coupes d’environ 5 µm ont ensuite été effectuées sur ces blocs à l’aide d’un microtome Leica. Une technique particulière à été utilisée pour éviter que l’implant ne s’effrite lors de la coupe. Celle-ci a été réalisée en appliquant sur la surface à découper un morceau de scotch qui assure l’intégrité de la céramique (Figure V.4). Les coupes des implants, collées sur ces morceaux de scotch, sont ensuite colorées pour l’analyse histologique.

Figure V. 4: Photographie de la préparation d’une coupe à partir d’un bloc de résine.

• Coloration des échantillons

Les coupes ont été traitées par la coloration Trichrome de Masson. Brièvement, pour réaliser la coloration, les morceaux de scotch sur lesquels sont collées les coupes sont d’abord placés dans une solution Hémalun de Mayer pendant 5 minutes. Après lavage dans de l’eau désionisée, les coupes sont trempées quelques secondes dans une solution saturée en carbonate de lithium, lavées à nouveau et trempées pendant quelques secondes dans une solution de Morrel et Bassal diluée au tiers. Après lavage, les échantillons sont placés dans une solution de rouge ponceau de xylidine pendant 5 minutes. Les coupes sont lavées puis placées dans de l’acide phosphomolybdique à 1% pendant 5 minutes. Les échantillons sont ensuite récupérés et directement placés dans une solution de bleu d’aniline ou de vert lumière, qui colorent la matrice collagénique en bleu ou vert foncés respectivement. Une fois ces colorations effectuées, l’analyse histologique des coupes peut être réalisée. Le noyau des cellules est coloré en rose foncé ou violet, le cytoplasme, le muscle et les érythrocytes sont colorés en rouge vif et les fibres de collagène apparaissent en bleu ou vert, selon le dernier colorant utilisé.

• Analyse quantitative de l’os néoformé

L’évaluation de la quantité d’os néoformé a été effectuée par histomorphométrie sur les coupes histologiques. Il s’agit d’une méthode de quantification semi-automatique développée sous le langage de programmation MATLAB® au laboratoire de biomécanique.

Cette analyse a été effectuée informatiquement à partir des photographies des coupes histologiques prises au microscope. Après assemblage des photographies pour obtenir une image globale de l’implant, des zones d’intérêt ont été déterminées manuellement. Ces zones correspondent aux pores de la céramique dans lesquelles la présence d’os sera quantifiée. Un nettoyage de l’image (manuel et semi-automatique) a ensuite été réalisé à l’intérieur de ces zones d’intérêt. Un programme de quantification des pixels colorés est ensuite mis en place et le résultat obtenu correspond au pourcentage d’os formé par rapport à l’aire globale de la céramique.

• Constitution de l’image

Nous avons cherché à obtenir des images de la céramique complète pour lesquelles les détails pouvaient être visualisés. Pour cela, à l’aide d’une caméra montée sur un microscope (Nikon, microscopie 80i ; logiciel elipse net), des photographies au grossissement x 40 ont été réalisées successivement pour toutes les zones de l’implant (Figure V.6a).

L’image de la céramique complète a ensuite été reconstituée par assemblage en utilisant l’extension Photomerge du logiciel Adobe Photoshop® 09. Cet outil permet de fusionner plusieurs images possédant des parties communes. L’image finale est constituée d’environ 2400x1700 pixels et est enregistrée en format jpeg (Figure V.6b).

Figure V.6 : Constitution de l’image.

• Détermination des zones d’intérêt

Différents contours ont été tracés manuellement sur chaque image à l’aide du logiciel The Gimp® et d’une tablette graphique Cintiq 21UX (Wacom Co.Ltd.). Un premier contour de couleur bleue délimite le bord de l’implant. Des contours rouges correspondant aux pores de la céramique ont ensuite été tracés afin de délimiter les zones d’intérêt dans lesquelles l’os sera quantifié (Figure V.7).

Figure V.7 : Détermination des zones d’intérêt.

• Nettoyage de l’image

Le programme de quantification réalisé mesure le nombre de pixels colorés (c'est-à-dire, les pixels qui ne sont pas blancs). Il est donc nécessaire d’effectuer un nettoyage du fond ou des colorations non spécifiques pour obtenir un résultat fiable.

Dans un premier temps, un seuillage dans l’espace de couleur TSV (Teinte-Valeur-Saturation) a été effectué. Tous les pixels ayant des valeurs de Teinte ou de Valeur inférieures à 0,3 sont alors transformés en pixels blancs. Une fois ce seuillage réalisé, la majorité des pixels non spécifiques sont éliminés sans modification des pixels présentant les couleurs d’intérêt.

Un nettoyage manuel a ensuite été réalisé pour éliminer les colorations non spécifiques (fibrose, céramique…) qui possèdent des caractéristiques trop proches de la couleur d’intérêt et qui sont donc toujours présentes après la mise en place des seuils. C’est cette image nettoyée qui correspond au fond utilisé pour la quantification finale (Figure V.8).

Figure V.8 : Photographie de l’image nettoyée utilisée comme image de fond pour la quantification

• Quantification du pourcentage d’os néoformé

Une fois ces différentes étapes effectuées, la quantification peut être réalisée de manière automatique. Le programme informatique crée des masques binaires à partir des contours précédemment définis et effectue des opérations booléennes pour transformer tous les pixels qui ne sont pas contenus dans les zones d’intérêts en pixels blancs (Figure V.9).

La quantification de l’os néoformé se fait alors par dénombrement du nombre de pixels colorés. Cette valeur est enfin rapportée au nombre de pixels contenus dans la zone bleue, qui caractérise la surface de l’implant. Le résultat obtenu correspond au pourcentage d’os néoformé par rapport à l’aire de la céramique pour chaque coupe histologique.

Les résultats sont ensuite transférés dans un fichier excel où ils peuvent être récupérés puis traités.

Figure V. 9 : Application des masques et transformation de l’image pour la quantification.