Le lait

L’ingestion de lait contaminé par Map est reconnue comme un vecteur de transmission de la maladie de Johne de la vache au veau, car le lait maternel et le colustrum sont les aliments de base avant le sevrage. L’hypothèse selon laquelle Map pourrait être impliqué dans la maladie de Crohn à susciter l’intérêt de plusieurs groupes de recherche pour la survie de Map sous des

barèmes de pasteurisation, en laboratoire (Grant et al., 1999; Pearce et al., 2001; Gao et al., 2002; Lund et al., 2002; Grant et al., 2005; Rademaker et al., 2007). La majorité des études ont démontré que Map était plus résistant que Salmonella, Listeria, Coxiella, M. tuberculosis et M.

bovis (Sung et Collins, 1998; Gao et al., 2002; Grant, 2005; Grant, 2006). Sung et Collins (1998)

ont déterminé les valeurs D et z de Map dans le lait. Les valeurs D en secondes obtenues étaient de 228,8, 47,8, 21,8 et 11,7 pour 62, 65, 68 et 71˚C, respectivement. La valeur z était de 7,11˚C. Grant et al. (1999) suggèrent que la pasteurisation à haute température pour un court temps (HTST pour high temperature short time) de 72˚C pendant 15 s ne serait pas suffisante pour détruire une concentration initiale de Map de 4 x 105 ufc/ml dans le lait. En effet, il y aurait entre 4 et 16 cfu/ml qui survivraient à ce traitement. Il propose d’allonger le temps d’exposition à 25 secondes. Ainsi, la réduction de la charge microbienne suite au traitement thermique variait de 5D à 5,4D. Une étude faite en Irlande (Grant et al., 2002) avec du lait contaminé naturellement avec Map suggère que la pasteurisation HTST n’est pas suffisante pour contrôler ce microorganisme. Les auteurs ont indiqué que 15 ou 25 secondes à 73°C ne permettent pas de détruire Map dans le lait s’il est présent en nombre suffisant. L’expérience ne mentionne pas la définition « être en nombre suffisant » puisqu’ils n’ont pas fait un dénombrement avant le traitement thermique. Toutefois, l’homogénéisation du lait avant la pasteurisation permettrait d’augmenter la létalité de Map (Grant et al., 2002; Grant et al., 2005). Grant et al. (2005), ont démontré que 10 à 20 ufc/ml de Map peuvent survivre à la pasteurisation si le microorganisme se trouve en assez grand nombre (105 ufc/ml) en phase stationnaire. Cette réduction équivaut à environ 4 à 5 log, ce qui devrait être suffisant pour contrôler Map dans le lait (Lund et al., 2002). Contrairement à Grant et al. (1999 et 2002), Rademaker et al. (2007) affirment que Map peut être contrôlé si on chauffe à 72°C pendant 15 s. À cette température, la valeur D calculée est de 1,2 s. Donc, en chauffant pendant 15 secondes, il est possible de réduire la charge microbienne de 12,5D. Il est important de signaler que dans cette étude, le lait était inoculé avec des fèces d’animaux malades ayant la paratuberculose. Donc, la physiologie de Map utilisé pour inoculer le lait se rapprochait beaucoup plus de l’état physiologique de Map lorsqu’il est dans l’environnement de l’étable et qu’il contamine le lait. Ceci expliquerait peut être la différence entre les résultats des deux études puisque Grant et al. (1999) ont utilisé du lait inoculé avec des souches de Map préparées en laboratoire. Une seconde étude (McDonald et al., 2005) confirme que la pasteurisation, à 72°C pendant 15 s, 75°C pendant 25 s ou encore 78°C pendant 15 s, est

amplement suffisant pour contrôler Map. Le lait a été inoculé pour obtenir une concentration finale variant entre 106 et 107 ufc/l. Ces traitements permettent de réduire la charge microbienne du lait de 6 log et le nombre de survivants était faible (2 à 4 ufc/l; McDonald et al., 2005). De plus, un fait intéressant à noter, et qui aurait vraisemblablement beaucoup d’influence, est que les souches de laboratoire sont plus résistantes que les isolats cliniques (isolées du lait, de patients, de fèces; Sung et Collins, 1998). Ainsi, il a été démontré que les souches cultivées in vitro sont aussi plus résistantes à la chaleur que celles qui poussent in vivo (Klijn et al., 2001; Merkal et al., 1981). Généralement, on retrouve dans le lait des vaches atteintes entre 2 et 8 ufc/ml de lait (Stabel et al., 2001; Lund et al., 2002). Ainsi, selon toute vraisemblance, la pasteurisation du lait serait largement suffisante pour contrôler Map adevenant une contamination acidentelle si la concentration initiale est de l’ordre de 105 ufc/ml.

7.2 Le fromage

La possibilité que Map se retrouve dans les produits laitiers, autres que le lait de consommation, a été également évaluée. Il n’existe cependant pas beaucoup de publications concernant la prévalence de Map dans ceux-ci. Toutefois, les fromages reçoivent une attention particulière puisqu’ils sont faits de lait pasteurisé ou de lait cru (Grant et al., 2001). Le pH et la concentration en sel du fromage ont un effet inhibiteur sur la croissance de nombreux microorganismes. Cependant, il a été démontré que les mycobactéries sont particulièrement résistantes et sont capables de survivre aux conditions acides retrouvées dans les phagosomes (European Commission, 2000). Elles seraient donc, théoriquement, en mesure de survivre aux conditions retrouvées dans le fromage (European Commission, 2000). Sung et Collins (2000) ont étudié la survie de Map dans un fromage à pâte molle de type espagnol ayant 2% de sel et un pH de 5. Ils ont découvert qu’une maturation de 28 jours n’était pas suffisante pour contrôler Map. De plus, les valeurs D sont plus élevées (D62 de 267,4 s et D71 de 21,3 s) que celles dans le lait (D62 de 228,8 s et D71 de 11,7 s). Ils ont suggéré qu’une pasteurisation couplée à une maturation du fromage de 60 jours permettait d’inactiver 103 ufc de Map par ml de lait (Sung et Collins, 2000). Dernièrement, des chercheurs de l’Université de Zurich ont démontré que Map pouvait se retrouver dans des fromages au lait cru. En effet, sur un total de 143 fromages Suisse au lait cru, 4,2 % de ceux-ci étaient positifs pour la présence de Map par un test PCR qui détectait le

fragment F57. Ceci démontre que les mesures entreprises pour minimiser l’exposition au public doit aussi inclure les autres produits laitiers (Stephan et al., 2007).

7.3 Le colostrum

Le colostrum est le liquide jaunâtre visqueux sécrété par la mamelle peu avant et peu après la naissance du jeune mammifère. Sa composition est très différente de celle du lait. Le colostrum contaminé peut infecter les jeunes veaux (Streeter et al., 1995). Il a été suggéré de procéder à la pasteurisation du colostrum directement sur la ferme pour réduire le risque de transmission des organismes pathogènes aux veaux naissants (Stabel, 2001). Cependant, les températures trop élevées diminuent la qualité du colostrum sans parler de la baisse en anticorps (Green et al., 2003; Stabel et al., 2004; McMartin et al., 2006). Pour remédier à la situation, un groupe de recherche du Département des sciences des aliments et de nutrition de l’Université du Minnesota a proposé de chauffer le lait à 60˚C pendant 30 secondes où aucune altération du milieu n’a été observée. Cependant, le temps du traitement n’est pas suffisant pour inactiver Map. Par contre, en prolongeant de 30 secondes le traitement à 60°C, il était alors suffisant pour contrôler Map (Godden et al., 2006).

7.4 Le boeuf

La viande issue des bovins a aussi été étudiés comme véhicule de la maladie chez l’homme (Grant, 2005; Jaravata et al., 2007). La viande hachée provenant de vaches de réforme pour la consommation humaine pourrait représenter une source de contamination par Map (Manning et Collins, 2001; Ryan et Campbell, 2006). La littérature concernant l’inactivation de Map dans les matrices de viande est pratiquement inexistante. Les quelques articles retrouvés datent de près 20 ans et concernent l’inactivation du complexe Mycobacterium intracellulaire dans les produits de bœuf et de porc. On peut toutefois en tirer certaines informations. Pour le traitement thermique des saucissons de type Wienners, le maintien d’une température de 71,1˚C pendant un minimum de 2 min permet de détruire 107 _{cellules de M. avium représentant un TDT de 12D (Merkal et al.,} 1979). Toutefois, quelques études nous indiquent que Map est en concentration faible sur la

surface de la viande. En effet, Jaravata et al. (2007) ont analysé plus de 200 échantillons de bœuf haché au détail par PCR multiplex en temps réel afin de détecter la présence de IS900. Tous leurs échantillons avaient moins de 101 ufc/g. Meadus et al. (2008) ont déterminé la prévalence de Map sur les carcasses de bœuf en abattoirs par un PCR en temps réel ayant comme cible IS900 et le fragment F57. De 6 à 54 % des échantillons étaient positifs pour IS900 et de 4 à 20% étaient positifs au fragment F57. Ces travaux ont permis de prouver que Map se trouve à une faible concentration ou en petits nombres sur plusieurs carcasses.

Hypothèse et buts

Depuis qu’un lien possible entre Map et la maladie de Crohn chez l’humain a été avancé, des inquiétudes en santé publique ont ainsi été soulevées. Bien que le lien entre les deux reste à établir, l’industrie bovine s’inquiète de voir apparaître un nouvel organisme pathogène émergent qui pourrait frapper encore une fois le secteur de la viande. Son contrôle ainsi que son rôle potentiel comme indicateur de l’efficacité thermique méritent d’être étudié. L'hypothèse de départ pour ce projet de recherche est que les traitements thermiques couramment utilisés dans le domaine de la viande sont suffisants afin de contrôler la présence de Map advenant une contamination accidentelle de la viande. Le but principal est d’établir le niveau de résistance à différents traitements thermiques dans la viande. La résistance thermique de Map est déterminée par la valeur D et z dans matrice liquide et de viande. Les résultats doivent être comparés à d’autres organismes particulièrement résistants tel qu’E. faecalis.

Finalement les objectifs spécifiques se résument à:

- Déterminer s’il y a un effet significatif de la température en milieux liquides pour E. coli ATCC 25922 et E. faecalis ATCC 7080.

- Déterminer s’il y a un effet significatif de la température dans la viande pour E. coli ATCC 25922, E. faecalis ATCC 7080 et Map.

- Déterminer s’il y a un effet significatif du milieu dans les capillaires pour E. coli ATCC 25922 et E. faecalis ATCC 7080.

- Déterminer s’il y a un effet significatif du milieu dans la viande pour E. coli ATCC 25922, E.

faecalis ATCC 7080 et Map.

- Déterminer s’il y a un effet significatif de la souche en milieu liquide et dans la viande pour E.

coli ATCC 25922, E. faecalis ATCC 7080 et Map.

- Évaluer l’impact du milieu de croissance en milieu liquide et dans la viande pour E. coli ATCC 25922 et E. faecalis ATCC7080.

Matériel et Méthode

Souches bactériennes et conditions de culture et d’entreposage

Les souches de Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis analysées sont la souche ATCC 19698 ainsi qu’une souche isolée à partir des fèces d’un cheptel infecté provenant de l’Ontario (gN27; Dr Lucy Mutharia, Université de Guelph, Ontario). La souche ATCC 19698 a été isolée à partir des fèces d’une vache ayant acquis naturellement la paratuberculose (American Type Culture Collection, 2007). Également, les souches de E. faecalis ATCC 7090 et E. coli ATCC 29522 ont aussi été étudiées. La première pour sa thermorésistance particulière (Reichert et al., 1979 cité par Marcotte, 1994) et la seconde parce qu’elle est un indicateur d’hygiène et de contamination fécale en transformation agroalimentaire incluant la viande et les produits carnés (Gill, 2000). Les lots de cultures de travail ont été préparés en centrifugeant (4080 x g, 4 °C, 10 min; Heraeus Multifige 1S-R, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Allemagne) 10 ml d’une culture ayant poussée pendant 24 h à 37 °C pour E. faecalis et E. coli (phase stationnaire, densité optique à 600m entre 0,9 et 1,1) et d’environ 51 jours pour Map (600 m de 0,5) ont été utilisé. Le culot est lavé deux fois avec 10 ml d’eau peptonée 0,1 % (p/v; Bacto peptone, Difco™,New Jersey, É.-U.) pour E. faecalis et E. coli, et avec du bouillon de culture Middlebrook 7H9 (7H9dilutant; Difco, BD, New Jersey, É.-U.) supplémenté avec du Tyloxapol (0,05% v/v; Sigma-Aldrich Canada Ltd, Oakville, ON, Canada) mais sans mycobactine J pour Map. Le culot a été suspendu dans 3,75 ml d’infusion cœur-cervelle (BHI; Difco™,New Jersey, É.-U.) pour E. faecalis et E. coli, et un bouillon de culture Middlebrook 7H9 (7H9culture) avec tyloxapol et mycobactine J (The Paratuberculosis Laboratory, Allied Monitor, Fayette, Missouri, É.-U.) pour les souches de Map. Un volume de 1,25 ml de glycérol (80% v/v; Calbiochem, EMD Chemicals Inc., San Diego, Californie, É.-U.) est ajouté, comme cryoprotectant, afin d’obtenir une concentration finale de 20 % (v/v). Des aliquots de 150 l sont conservés à -80 ˚C.

Préparation des suspensions bactériennes pour les traitements

Les cultures utilisées dans les expériences ont été produites directement à partir des cultures congelées à -80 ˚C inoculées dans 5 ml de bouillon BHI commercial pour E. faecalis et E. coli, et du 7H9culture pour Map. Toutes les cultures de travail sont repiquées un minimum de deux et un maximum de 7 fois avant d’être utilisées afin de préserver l’intégrité des souches vis-à-vis les mutations potentielles. Les sous-cultures (1% v/v) sont incubées à 37˚C pendant 24 heures pour

E. faecalis et E. coli. Pour Map, les cultures sont incubées à 37˚C jusqu’à ce qu’une D.O.600 de 0,5 soit atteinte soit environ 51 jours. Les cultures de Map sont agitées 100 coups une fois par semaine, car Map, ayant besoin d’oxygène, a tendance à sédimenter. Les cultures de travail de E.

faecalis et E. coli sont préparées dans du bouillon BHI commercial et alternativement dans un

bouillon d’extrait de viande (meat extract; ME à 2% d’azote totale; ME2; EMD Chemicals Inc., Gibbstown, New Jersey, É.-U.). L'extrait de viande provient des tissus d’animaux (bœuf) ne contenant ni graisse et ni tendon. Toutes les cultures de travail sont centrifugées et lavées tel que décrit précédemment. Pour le traitement thermique utilisant la méthode des capillaires élaborée par Splittsoesser et al. (1996), le culot des cultures de E. faecalis et E. coli est resuspendu dans 10 ml de BHI, ME2 ou ME à 10% (ME10) d’azote totale acidifié au pH de la viande (5,6) avec de l’acide lactique. Pour l’évaluation du traitement thermique dans le boeuf haché, le culot des souches est resuspendu soit dans 1 ml de BHI ou de ME2 pour les cultures de E. faecalis et E.

coli ou 0,5 ml de 7H9culture pour les souches de Map. Afin d’obtenir une concentration dans la viande de 107 ufc par grammes de viande, 100 µl de la suspension bactérienne lavée ont été ajoutés à 25g de viande.

Map est cultivée dans un bouillon de culture 7H9culture ainsi que sur des géloses Middlebrook 7H11 (7H11, Difco™ et BBL™, BD, New Jersey, É.-U.). Puisque la croissance de Map est dépendante de la présence de mycobactine J ferrique, il faut ajouter 2 mg/l de ce sidérophore. Des suppléments en nutriments sont aussi ajoutés au milieu tels que le glycérol (2 g/l) et l’albumine- dextrose-catalase (ADC; 100ml/l). Du tyloxapol est ajouté afin de favoriser la croissance bactérienne. L’agar 7H11 contient 21 g d’agar mycobactériale 7H11 déshydraté, de la mycobactine ferrique J (2 mg/l), du glycérol (5 g/l) et d’ADC (100 ml/l). De la pénicilline G (100 000 unités/l) et du choramphénicol (50 mg/l) sont également ajoutés dans le milieu solide en

quantités non-létales pour Map; ils préviennent la détérioration et la contamination bactériennes pendant les longues périodes d’incubation (Sparks, 1998). Le bouillon de culture 7H9 est utilisé pour l'isolation, la croissance et l’identification de l'espèce Mycobacterium. L’agar 7H11 est utilisé pour l'isolation sélective et la croissance des cultures de mycobactéries pathogéniques d’échantillons potentiellement contaminés de bactéries ou de moisissures. Ce qui expliquerait, en partie, la différence de concentration en glycérol. La préparation des dilutions pour le dénombrement cellulaire se fait dans du bouillon 7H9diluant c’est à dire sans mycobactine. Au meilleur de notre connaissance, aucune littérature ne révèle l’avantage d’utiliser de l’eau peptonée comme diluant pour Map. Puisque Map est un organisme fastidieux, ayant un temps de génération qui dépasse les 20 heures (Coetsier et al., 1998; Lambrecht, et al., 1998; Rowe et Grant, 2006), il est préférable d’utiliser un diluant maximisant sa viabilité (Sparks, 1998).

Préparation des échantillons de viande

La viande hachée maigre préparée aseptiquement (Greer et Jones, 1991; Saucier et Greer, 2001; Figure 10) est obtenue à partir du muscle semimembranosus de bœuf Angus AAA provenant d’une boucherie locale de la région de Québec. Le muscle entier est immergé dans de l’éthanol 95% puis suspendu avant d’être enflammé. Ces étapes sont répétées deux fois. L’excédant d’alcool est éliminé à l’aide d’une flamme (torche à souder BernzOmatic, Wilmington, Ohio, É.- U.) qui est appliquée sur toute la surface du muscle. La pièce de viande ainsi décontaminée est placée dans un plateau stérile recouvert de papier d’aluminium stérile et acheminée sous une hotte à flot laminaire (Canadien Cabinets Co Ltd, Canlab, Ottawa, Canada). Dans cet environnement stérile, l’intérieur de la viande est retiré de façon aseptique. Puisque l’intérieur d’un muscle provenant d’un animal en santé est stérile ou contient peu de microorganismes (Price et Schweigert, 1987), il est donc possible d’obtenir une viande hachée dont la population initiale est faible (< 10 ufc/g de viande) ce qui permet d’étudier les organismes d’intérêt en limitant l’influence de la flore indigène.

Figure 10. Procédures pour obtenir de la viande préparée aseptiquement.

L’intérieur du muscle est retiré en petits morceaux (environ 3 x 3 x 3 cm) puis déposé dans des casseroles d’aluminium stériles et entreposé au réfrigérateur jusqu’au hachage (maximum 3 heures). La viande est hachée aseptiquement dans un moulin à viande en acier stérilisé, puis elle est entreposée au réfrigérateur. La viande est ensachée en échantillons de 25 ± 0,5 g dans des sacs Whirl Pak™ de 11.4 cm x 22.8 cm (18 oz.; Nasco, Fort Atkinson, Wisconsin, É.-U.). Les échantillons sont conservés à -20˚C jusqu’à leur utilisation.

Composition de la viande

Le pourcentage d’humidité de la viande a été déterminé par une méthode simple. Trois échantillons de 25 g de viande ont été séchés dans un lyophilisateur (modèle 50 SRC, Virtis Co., Gardnier, New York, É.-U.) pendant 7 jours. Ces échantillons sont par la suite pesés. Le rapport entre le poids du produit sec sur le produit frais multiplié par 100 donne le pourcentage de matière sèche. En soustrayant ce nombre à 100% on obtient alors le pourcentage d’humidité. La composition en gras de la viande a été déterminée selon la procédure 991.36 de l’Association of Official Analytical Chemists (AOAC, 1995) utilisant le système Soxtec (Soxtec systeme HT 1043, Tecator, Hoganas, Suède). Trois échantillons de 25 g de viande ont été séchés dans un

lyophilisateur (modèle 50 SRC, Virtis Co., Gardnier, New York, É.-U.) pendant 7 jours. Une fois séchée, la viande a été moulue avec un moulin à café (modèle 203, Krups, New Jersey, É.-U.). Une quantité de 3 g est déposée dans des cartouches d’extraction de cellulose de 25 x 80 mm (modèle 603, Whatman Inc. Florham Park, New Jersey, É.-U.). Du sable est incorporé à l’aide d’une tige de verre. Les cartouches ont été séchées 1h à 125˚C au four (Isotemp Oven, 200 Series, Model 230F, Fisher Scientific Company, Ottawa, Canada). Les tiges de verre ont été nettoyées avec du coton. Ce dernier est déposé dans les cartouches. Les cartouches sont ensuite installées dans le système d’extraction et 40 ml d’éther de pétrole sont ajoutés par échantillon. L’échantillon est maintenu en position boiling pendant 25 minutes et 30 minutes en position

rinsing. Les cartouches ont été séchées 30 minutes à 125˚C au four et refroidies dans un

dessiccateur avant d’être finalement pesées.

Le dosage des protéines a été fait par l’analyse de l’azote total à l’aide d’un système analyseur automatique d’azote et de protéines LECO® (modèle FP-2000, Leco Corporation, St-Joseph, Michigan, É.-U.). Avant de débuter l’expérience, l’appareil est calibré avec des doses connues et standardisées d’azote. Un échantillon séché de 0,5g est placé dans une barquette en céramique et déposé dans l’appareil. Les échantillons sont oxygénés à 1100˚C et l’azote organique de l’échantillon est transformé en azote inorganique. Les gaz interférents et l’eau sont éliminés à l’aide d’absorbants, les oxydes d’azote sont réduits et la concentration d’azote est déterminée par un détecteur de thermoconductibilité. Par une règle de trois, les résultats sont convertis en masse humide et multipliés par un facteur de 6,25. Puisqu’il a fallu quatre muscles entiers pour générer la quantité de viande nécessaire à la réalisation de l’expérience, trois échantillons par pièce ont été testés. L’expérience a permis de déterminer que la viande utilisée dans les expériences contenait 7,5  1,4 % de gras, 72,7  2,2 % d’humidité Et 23,9  1,5% de protéines.

Traitements thermiques

En milieu liquide, la méthode utilisée pour traiter thermiquement les cellules est celle décrite par Splittsoesser et al. (1996). Des échantillons de 40 l de la suspension bactérienne cultivée dans le BHI ou le ME2 sont aseptiquement injectés dans des tubes capillaires (5) de 1,8 X 90 mm (Corning Pyrex, New York, É.U.) à l’aide d’une seringue de 1 ml adaptée à un système de distributions répétées (Hamilton Company, Reno, Nevada, É.-U.). Les tubes sont scellés à l’aide d’un chalumeau au butane (modèle Iroda PT200, Chagrin Falls, Ohio, É.-U.). Les capillaires sont submergés dans de l’eau tempérée contenue dans des éprouvettes placées dans un bain chauffant maintenu à des températures variant de 50 à 70 ˚C. Un bain chauffant avec agitation (Model 1217, Sheldon Mfg. Inc., Cornelius, OR, É.-U.) ayant une de précision  0,2˚C a été utilisé pour la souche de E. coli (laboratoire de bioconfinement de niveau 1), tandis que E.

faecalis et Map ont été testés dans un bain chauffant programmable avec circulation (Cole-

Palmer Polystat Heated Circulating Bath, Cole-Parmer Canada Inc., Anjou, Québec, Canada) ayant une précision de  0,001˚C (laboratoire de bioconfinement de niveau 2). Les échantillons sont chauffés suivant des couples temps-température spécifiques prédéterminés et chaque couple temps/température a été répété trois fois.