Le manque de méthodes sensibles et rapides pour la détection du Map constitue un problème pour la détection de cet organisme notamment dans le lait et le colostrum. Des méthodes de détection rapides et sensibles sont pourtant essentielles afin de dépister la présence de Map dans le lait ou le colostrum avant d’alimenter le nouveau-né suite à la mise bas et de risquer de ce fait la propagation de l'infection aux animaux nouveaux dans un troupeau. Depuis quelques années, la recherche a permis le développement de tests de diagnostic dont plusieurs sont disponibles sous forme de trousses aidant à standardiser les protocoles (Boor, 2001). La détection par culture ou par détection d’éléments génétiques uniques à l’organisme (IS900) ont le désavantage principal d’être coûteux. Cependant, les tests sérologiques basés sur la technologie ELISA offre plus de précision et sont moins dispendieux (Collins, 2003a).
5.1 Les méthodes de diagnostic
5.1.1 La mise en évidence de la bactérie à partir d’un échantillon de selles, méthode directe
5.1.1.1 Microscopie et histopathologie
Les cellules de Map colorées par la méthode de Ziehl-Neelsen peuvent être observées en microscopie à partir d’un échantillon de fèces ou d’organes infectés. Le diagnostic dépend de la visualisation d’amas ou de cellules de mycobactéries ayant une teinte rouge et est purement qualitatif. C’est un test simple et économique (European Commission, 2000; Douart et al., 2002). Cependant, cette technique présente des inconvénients comme les faux négatifs (lorsque la concentration de cellules est inférieure à 105 ufc/ml : sensibilité) et les faux positifs (confondre une bactérie avec une autre : spécificité). La bactérioscopie n’est utilisée que pour des animaux présentant des signes cliniques dû à son manque de sensibilité et de spécificité. Habituellement ce
test est effectué en association avec un test sérologique (Douart et al., 2002). De plus, ce test est d’autant plus inefficace si la bactérie a perdu sa paroi cellulaire car il n’est plus possible de la colorer.
L’histopathologie permet d’obtenir un diagnostic rapidement. Elle se fait à l’examen des tissus suite à la nécropsie. Puisque les lésions se trouvent principalement dans la sous muqueuse intestinale, l’histopathologie se fait à partir des nœuds lymphatiques mésentériques10, de l’iléum et de l’intestin. À l’examen clinique, l’iléum est ondulé et épaissi et les nœuds lymphatiques montrent de l’œdème avec une abondante charge en cellules géantes polynuclées. L’analyse confirme la présence d’amas de bacilles acido-alcoolo-résistants colorés par la méthode de Ziehl- Neelsen dans les tissus granulomateux (Cocito et al., 1994; Englund, 2002 ).
5.1.1.2 La culture in vitro
Le diagnostic par la méthode de culture standard sur milieux solides est couramment utilisé. Sa sensibilité est entre 30 et 40 %, mais sa spécificité est presque de 100%. Cette méthode détecte très peu de faux positifs, cependant sa faible sensibilité donne plusieurs faux négatifs. Son utilisation est dispendieuse et requiert beaucoup d’espace (incubateur). La méthode de culture standard peut prendre jusqu’à 16 semaines d’incubation avant que des colonies ne soient visibles dû à la croissance lente de ce microorganisme (Checkley et al., 2001; Collins, 2003c). Toutefois, selon les chercheurs, cette méthode est la référence (gold standard) et est encore fréquemment utilisée (European Commission, 2000; Checkley et al., 2001; Englund, 2002; Collins, 2003c). Une méthode plus rapide a été mise au point afin d’accélérer la détection de Map (8 semaines au lieu de 16 semaines en utilisant les méthodes standards). Il s’agit du système automatisé BACTEC™. Cette méthode est basée sur la détection de radio-isotopes (Collins, 2003c). L’échantillon est cultivé dans un milieu liquide contenant un substrat marqué au C14 qui est métabolisé durant la croissance de Map. Le CO214 peut ainsi être mesuré dans une phase liquide au-dessus de la culture (Lambrecht et al., 1988; Collins et al., 1990; Cousins et al., 1995;
10 Qui se réfère au mésentère. Repli péritonéal unissant le jéjuno-iléon à la paroi, et contenant dans son épaisseur les
vaisseaux mésentériques supérieurs ainsi que leurs principales branches (tel que cité dans Le Grand dictionnaire terminologique; Office québécois de la langue française, 2007).
European Commission, 2000; Englund, 2002). L’inconvénient est les risques de contamination par d’autres mycobactéries et procaryotes qui peuvent limiter quelques fois la détection de Map (Englund, 2002). Il est donc préférable d’avoir une pré-décontamination afin de limiter la croissance des autres bactéries (voir partie 4.2).
5.1.1.3 Réaction en chaîne de la polymérase (PCR)
La science, constamment en évolution, permet de développer des méthodes toujours plus sensibles pour détecter les microorganismes, incluant Map, dans les échantillons de fèces et de produits laitiers (Grant et al., 2000; Hulten et al., 2001; O'Mahony et Hill, 2002; Jayarao et al., 2004; Buergelt et Williams, 2004 cité par Bhide et al., 2006). Parmi les progrès récents, on peut noter l’utilisation des méthodes basées sur la biologie moléculaire tel que la réaction en chaîne de la polymérase dite PCR (Vary et al., 1990; Moss et al., 1991 cité par European Commission, 2000).
Tel que mentionné, la séquence d’insertion IS900 a été utilisée pour la détection de Map par méthode PCR. Cette technique, en plus de sa rapidité (en heures au lieu de semaines), offre un niveau de spécificité et de sensibilité (102 ufc/ml) beaucoup plus élevé que les tests précédents (Vary et al., 1990).
Bien que la méthode PCR soit encore utilisée, la méthode PCR en temps réel gagne du terrain puisqu’elle permet à la fois la détection mais aussi la quantification de l’organisme dans l’échantillon. O'Mahony et Hill (2002) ont développé une méthode utilisant cette technologie dans le but de détecter et de quantifier Map. En utilisant des amorces spécifiques (P90 et P91) marquées avec du vert fluorescent Synergy Brands inc. (SYBR), ils ont été en mesure d’amplifier une petite région de 400 pb dans IS900 et de suivre l’évolution du nombre d’amplicons. Cette méthode a l’avantage de pouvoir se réaliser en présence de contaminants. L’analyse et la réaction complètes prennent moins de 40 minutes (O'Mahony et Hill, 2002). Puisque d’autres lignées de mycobactéries semblent aussi contenir IS900 (Englund et al., 2002), d’autres marqueurs devront être ciblés par PCR en temps réel tel que le segment F57. Ce segment est unique chez Map et se retrouve en une seule copie dans son génome, son rôle n’est pas encore connu. Une équipe a été en mesure de mettre au point une méthode de PCR en temps réel pouvant mettre en évidente ce
fragment F57 (Tasara et Stephan, 2005; Bosshard et al., 2006). Aucun problème face à la présence de faux positifs n’a été observé grâce à la forte spécificité de ce test. De plus, cette méthode d’analyse est capable de détecter jusqu’à 10 ufc/ml dans le lait (Tasara et Stephan, 2005). Le fait qu’il ne soit présent qu’en une seule copie dans le génome de Map réduit toutefois la sensibilité comparativement à une cible plus nombreuse tel IS900 (Herthnek et Bölske, 2006). À noter que plusieurs autres méthodes de PCR en temps réel ont vu le jour depuis la dernière décennie afin de détecter plus rapidement avec plus de spécificité et de sensibilité la présence de Map (Bogli-Stuber et al., 2005; Brey et al., 2005; Stabel et Bannantine, 2005; Stanley et al., 2007). Toutefois puisque la méthode PCR ne permet pas de différencier les cellules mortes de celles qui sont vivantes, une méthode peu coûteuse a été mise au point afin de détecter rapidement la présence de cellules vivantes de M. tuberculosis grâce à un phage (Rees et Loessner, 2005). Cette méthode portant le nom de The FASTPlaqueTB assay a aussi été testé avec Map. La méthode consiste à incuber l’échantillon a testé avec un phage (D29 pour Map). À ce moment un virucide est ajouté au mélange afin de détruire tous les phages n’ayant pas infectés une cellule. Pour détecter les phages protégés par les cellules hôtes, on ajoute M. smegmatis et de l’agar. Les géloses sont incubées toute une nuit. La lyse des cellules relâche les phages qui viennent infecter M. smegmatis. S’il y a apparition de plages de lyse, alors on est en présence de cellules vivantes dans l’échantillon. Cette méthode de détection mixte infection phagique-PCR permet de détecter Map en 48h (Stanley et al., 2007).
5.1.2 La détection d’anticorps par diverses techniques, méthode indirecte
5.1.2.1 La fixation du complément (TFC)
Ce test permettant de détecter les molécules participant à la fixation du complément est l’un des plus employés. Il permet de travailler sur plusieurs échantillons et sa sensibilité assez élevée permet de travailler sur des échantillons cliniques. Cependant, ce type d’analyse est beaucoup moins spécifique que les autres tests visant la réponse immunitaire (détection d’anticorps ou d’antigène; Yokomizo et al., 1991; Sockett et al., 1992; Ayele et al., 2001). Il est fréquemment utilisé pour l’importation et l’exportation, mais il n’est pas recommandé comme méthode de diagnostic de routine dû à la présence élevée de faux positifs et négatifs (Ayele et al., 2001).
5.1.2.2 ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay) est un test sérologique dans lequel un antigène ou un anticorps est détecté à l’aide d’un ligand couplé à une enzyme qui convertit un substrat chromogène en en produit coloré (Janeway et al., 2003). Elle est plus spécifique que le TFC, due à l’étape d’adsorption avec M. phlei qui retire tous les anticorps non spécifiques qui peuvent causer des réactions croisées (Yokomizo et al., 1985 cité par Hilbink et al., 1994; Milner et al., 1987 cité par Jark et al., 1997; Manning et Collins, 2001). Ce test de diagnostic basé sur la détection des anticorps dans le sérum n’est pas particulièrement utile pour la détection précoce de la maladie, car les animaux ne développent pas une réponse immunitaire immédiatement après l’infection. Sugden et al. (1987) ont réussi à isoler des lipoarabinomannanes (LAM) et des arabinomannanes (AM) des cellules de Map. Puisque les AM ont déjà été utilisés avec succès dans le diagnostic de la lèpre (Miller et al., 1983 cité par Jark et al., 1997), l’idée fût évaluer d’utiliser les LAM afin de dépister de la même manière Map (Sugden et al., 1989; Jark et al., 1997). Ce test peut servir notamment d’outil pour établir le niveau d’infection dans un troupeau entier d'animaux adultes (Englund, 2002). C’est depuis peu que les tests par ELISA sont utilisés pour détecter Map dans le lait. Un test a été mit sur pied par l’Institut Pourquier et est maintenant disponible en trousse (van Weering et al., 2007). Ce test a démontré une spécificité de plus de 98,8 % (Gumber et al., 2006; van Weering et al., 2007).
5.1.2.3 Immunodiffusion sur gel d’agarose (IDGA)
L’immunodiffusion permet la détection d’un antigène ou d’un anticorps par la formation d’un précipité de complexes antigènes/anticorps dans un gel d’agarose. Les protéines en général et les immunoglobulines ou les substances antigéniques en particulier, possèdent la propriété de diffuser dans la gélose. Il suffit donc de percer des puits disposés de façon équidistante dans la gélose contenue dans une boîte de Pétri, d'y déposer les substances à tester pour que 24 à 48 h plus tard, les substances se soient rencontrées. S'il s'avère qu'un sérum contient des anticorps (immunoglobulines) spécifiques à l'une des substances antigéniques présentes, il y aura alors formation, à égale distance des deux puits concernés, d'un précipité en forme d'arc correspondant au complexe immun (Janeway et al., 2003). En général, l’antigène utilisé est un antigène
protoplasmique de Map (PPA) ou encore des dérivés protéiques purifiés(PPD)comme la johnine (Ferreira et al., 2002; Hines et al., 2007). Cette méthode a été employée avec succès dans le programme de contrôle de la paratuberculose chez le boeuf, le mouton et la chèvre aux État-Unis (Manning et Collins, 2001). Dans la régie des troupeaux, cette analyse s’est avérée très utile pour confirmer les animaux suspects qui présentaient des signes cliniques. Cependant, elle n’est pas largement utilisée en raison de son faible taux de sensibilité et de spécificité pour cribler un troupeau qui ne présente pas encore de signes cliniques (Ferreira et al., 2002).