compartiment cytoplasmique mais aussi d ’éliminer des pathogènes intracellulaires tels que des bactéries, des virus et M. tuberculosis si l’on considère qu’il puisse s’échapper dans le cytoplasme. La séquestration des composés est amorcée par la formation du phagophore (i) qui en fusionnant avec des vacuoles cytoplasmiques permet l’extension de cette double membrane et aboutit à la formation de l’autophagosome (ii). Cette étape de maturation est régulée par les protéines ATGs qui interagissent avec hVP34 pour accumuler du PI3P à la surface de l’autophagosome. Cette accumulation du PI3P permet à l’autophagosome de fusionner avec les lysosomes notamment grâce à la petite protéine G IRGM-1 qui tout comme pour la phagocytose favorise la lyse bactérienne. Ce stade final appelé autolysosome (iii) possède des caractéristiques communes avec le phagolysosome. La double membrane interne de l’autophagosome y est dégradée et les constituants lysosomaux contribuent à l’acidification du pH et la dégradation de son contenu. B- L’autophagosome peut former un amphisome (iv) en fusionnant avec un hétérophagosome résultant du processus d’endocytose et qui peut soit être adressé vers la voie de phagocytose normale soit vers l’autophagie. C- L’autophagocytose peut aussi résulter d’un processus d’adressage spécifique des bactéries intracytoplasmiques (v). Ainsi dans le cas de M. marinum l’enveloppe mycobactérienne est ubiquitynilée ce qui favorise l’adressage de la mycobactéries vers la voie d’autophagocytose permettant sa dégradation. D- Ce processus
d’autophagocytose est régulée par les TLRs et peut être induit par les cytokines pro-Th1 alors qu’il est réprimé par l’IL4 et l’IL13. De même dans des conditions d’insuffisance en nutriments (Nut) et de facteurs de croissance (FC) elle est fortement activée alors qu’elle est réprimée par TOR. Addapté de
Klionsky et al, 2007. Phagophore Autolysosome Hétérophagie Endocytose Phagocytose Autophagosome Lysosome PI3P IRGM1 Adressage via ubiquitinylation (M. marinum) Déprivation (Nut / FC) Cytokines Pro-Th1 TLRs Jnk IRGM (rapamycine) Abondance (Nut / FC) Insuline-Akt-TOR IL4 / IL13 Amphisome A B C ub ub ub ATGs hVP34 (i) (ii) (iii) (v) (iv) D M. tuberculosis
- 52 - déficients pour CFP10 ou RD1. De plus, la survie cytosolique ne semble pas forcement être une bonne voie d’échappement car elle favoriserait l’activation de l’inflammasome via les NLRs permettant l’activation des macrophages et l’induction de processus bactéricides tels que l’apoptose et l’autophagie.
Bien que la localisation subcellulaire du bacille soit encore discutée, sa multiplication induit l’accumulation d’antigènes mycobactériens dans le cytosol et dans l’ensemble de la cellule- hôte. Cette accumulation entraîne une induction de certains PRRs tels que les NLRs afin d’induire la sécrétion de cytokines telles que le TNF ou de voies de transduction telles que celles de p38MAP-kinase. Ces inductions peuvent entraîner des processus de défense basés soit sur le détournement du système de recyclage cytosolique appelé autophagie, afin de dégrader un pathogène intracellulaire, soit en induisant le processus de mort cellulaire programmée : l’apoptose.
(3) L’auto-phagocytose ou autophagie (Figure 18)
L’autophagie est un processus cellulaire ubiquitaire permettant le maintien de l’homéostasie. Ce processus ancestral qui est conservé dans l’ensemble du règne eucaryote permet de recycler le matériel intracytoplasmique. C’est un mécanisme de contrôle de la quantité et de la qualité de la biomasse intracellulaire qui permet de recycler aussi bien des protéines que des organelles cytoplasmiques (Ashford and Porter, 1962; Mizushima et al., 2008). L’autophagie ou auto-phagocytose est le terme couramment utilisé pour décrire les processus de macro- autophagie permettant de séquestrer de grosse quantité de cytosol ou bien des organelles complets.
Ce processus se déroule en trois étapes (Figure 18): tout d’abord une étape d’initiation pendant laquelle la cellule émet une double membrane d’isolement à partir de la fusion de vésicule de transport provenant de l’appareil de Golgi. Cette double membrane interagit avec des protéines CARGO et peut dans un deuxième temps procéder à l’étape d’élongation afin de séquestrer les cibles dans une vésicule appelée auto-phagosome. Enfin, l’étape ultime de maturation consiste en une fusion avec des lysosomes afin de former l’auto-phagolysosome et de procéder à la dégradation de son contenu. L’autophagie est aussi connue sous le nom de « xénophagie », en effet ce processus joue aussi un rôle très important dans la protection contre les pathogènes intracellulaires en permettant la capture et la dégradation de formes cytosoliques libres (virus, L. monocytogenes) mais aussi de formes vacuolaires telle que pour M. tuberculosis, et l’élimination de certains facteurs de virulence tels que des toxines (Alonso et al., 2007; Biswas et al., 2008; Deretic and Levine, 2009; Gutierrez et al., 2004).
- 53 - Ce processus est hautement régulé notamment via la cascade de transduction inhibitrice AkT/mTOR. Elle peut être induite en réponse à différents stimuli tels que le stress, la privation de nutriments et de facteur de croissance, la présence de cytokines pro- inflammatoires (réponse de type Th1), les cascades en aval de la stimulation des TLRs, et les ROIs. A l’opposé, elle est inhibée lors d’une présence abondante de facteurs nutritifs, dans un environnement de type Th2 et par des hormones telles que l’insuline qui active la cascade AKT/mTOR (Virgin and Levine, 2009). L’inactivation de cette cascade par la mise en culture dans des milieux minimum ou l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques tels que la rapamycine induit l’autophagie (Jacinto and Hall, 2003; Noda and Ohsumi, 1998).
L’induction de l’autophagie se caractérise donc par l’interaction de complexes protéiques à la surface de vésicules de transports permettant la fusion membranaire. Ce processus fait intervenir une trentaine de gènes ATG (autophagy related genes). L’activation du complexe formé par la PI3-kinase VPS34 (cf phagocytose) et la bectine-1 (ATG6) permet le recrutement de LC3 (ATG8). Ce complexe protéique catalyse l’acylation de LC3-PE (LC3- II). Cette étape précoce est régulée par la phosphatase Jumpy chez les mammifères qui en hydrolysant le PI3-P inhibe l’autophagie (Vergne et al., 2009). Ce complexe interagit avec ATG5 et ATG12 qui sont les facteurs essentiels pour l’élongation du phagophore. Ils favorisent le recrutement des vésicules de transports et permettent d’isoler les structures cytosoliques en interagissant avec des protéines CARGO de l’autophagie telle que p62 (Pankiv et al., 2007) et NBR1 (Kirkin et al., 2009a) qui, en reconnaissant des motifs d’ubiquitination, permettent d’adresser des agrégats protéiques vers cette voie de dégradation (Kirkin et al., 2009b; Kirkin et al., 2009c). Une fois l’autophagosome formé, le complexe ATG5 et ATG12 est dégradé à la face interne de la double membrane autophagosomale alors que le LC3-PE est maintenu à la fois sur les membranes interne et externe. Dès lors, la maturation de ce compartiment se fait grâce à des fusions avec les lysosomes induisant l’acidification, la dégradation de LC3II à la face interne et la lyse de son contenu par des lipases, DNAses, RNAses, protéases, glycosidases, ainsi que l’accumulation de peptides anti- microbiens (Deretic and Levine, 2009).
Bien que de nombreux PAMPs aient été décrits comme pouvant moduler l’autophagie dans différents modèles d’infection, les processus d’inductions de xénolyse sont pour l’instant peu connus et peuvent aussi bien résulter de processus stochastiques, d’une voix alternative de l’hétrophagie (phagocytose, endocytose) ou bien de processus ciblés impliquant des CARGO spécifiques des pathogènes intracellulaires (Figure 18) (Deretic and Levine, 2009). Ce système d’adressage pourrait faire intervenir des protéines intracellulaires ou des réactions
- 54 - telles que l’ubiquitination afin de pouvoir cibler de manière spécifique les corps étrangers dans la cellule. Ainsi dans un modèle d’étude de l’infection de D. melanogaster par L. monocytogenes un facteur essentiel d’induction de l’autophagie a pu être mis en évidence, il s’agit d’un PRR reconnaissant le peptidoglycane dans les cellules de l’hémolymphe : PRGP- LE (Yano et al., 2008). L’auto-phagocytose en favorisant la dégradation des corps étrangers favorise l’activation de la réponse immunitaire adaptative en permettant la présentation d’antigènes par le CMHII, le CMHI et les molécules CD1 afin d’activer la réponse lymphocytaire (Deretic and Levine, 2009).
Dans le cadre de l’infection par M. tuberculosis, l’autophagie est un moyen de dégrader ce pathogène lorsqu’il persiste dans la cellule-hôte soit dans un phagosome immature soit dans le cytoplasme (Gutierrez et al., 2004). L’induction de l’autophagie par la rapamycine ou par la mise en culture des cellules dans un milieu minimum induit la maturation de la vacuole mycobactérienne. Le pH s’acidifie, il y a acquisition de facteurs bactéricides lysosomiaux mais aussi recrutement de marqueurs autophagiques (LC3II, Beclin I) au niveau du phagosome mycobactérien permettant au macrophage de dégrader M. bovis BCG et M. tuberculosis (Gutierrez et al., 2004). Cette maturation de la vacuole vers une voie analogue à l’autophagie provoquant la dégradation des mycobactéries est induite par l’IFNγ dans les macrophages humains (Gutierrez et al., 2004). Chez la souris, cette cytokine pro- inflammatoire (Th1) interagit avec son récepteur et active une petite protéine G de la réponse immunitaire (IRGM1) qui induit la maturation du phagosome mycobactérien en auto- phagosome en recrutant NOS2, en favorisant la fusion avec des endosomes tardifs et en activant l’autophagie. Les souris IRGM1-/- ne parviennent pas à activer la maturation du phagosome mycobactérien (MacMicking, 2005; MacMicking, Taylor, and McKinney, 2003; Miller et al., 2004). Chez l’homme, l’homologue de IRGM1 est appelé LRG47 (IRGM). Bien que cette petite protéine G ne soit pas induite par l’IFNγ son accumulation dans les MPs primaires humains favorise la lyse bactérienne grâce à d’autres acteurs de l’autophagie (Gutierrez et al., 2004).
Le rôle de ces petites protéines G dans la réponse anti-mycobactérienne et le contrôle de l’infection est renforcé par une récente étude de génétique des populations (Intemann et al., 2009). Dans cette étude de cas-contrôle au Ghana sur 2010 patient atteints de tuberculose et VIH négatifs versus 2346 contrôles, une association entre un génotype particulier du gène codant pour IRGM1 et une protection contre des formes d’infection spécifiques par des souches européennes de M. tuberculosis a pu être mise en évidence alors qu’il n’y a pas de protection ni contre les autres souches de M. tuberculosis ni contre les tuberculoses induites
- 55 - par M. bovis ou M. africanum. Ce génotype en induisant une surexpression de IRGM in vivo pourrait ainsi favoriser l’activation de l’autophagie et protéger contre les formes de tuberculose induites par les souches Euro-Américaine de M. tuberculosis (Intemann et al., 2009).
Un autre facteur de régulation de l’autophagie est le récepteur P2X7 qui, lorsque des cellules sont stimulées par de l’ATP, permet de moduler le flux de calcium, d’induire la maturation du phagosome de BCG et d’entraîner l’acquisition de marqueurs d’autophagie pour permettre la dégradation de la mycobactérie (Biswas et al., 2008). Le role de P2X7 dans la régulation de la bactéricidie via l’autophagie peut expliquer l’existence d’une association entre certains allèles du gène P2X7 et la susceptibilité à l’infection en Gambie (Li et al., 2002). De plus il a pu être montré que le SNP A1513C est associé à un risque accru de développer des tuberculoses extra-pulmonaires (Fernando et al., 2007) et qu’il est à l’origine d’une diminution de la résistance des macrophages à l’infection (Saunders et al., 2003).
Si l’on considère la possibilité d’échappement de la mycobactérie dans le cytosol l’autophagie peut jouer pleinement son rôle dans la dégradation de la mycobactérie. Dans le cas de M. marinum qui s’échappe dans le cytosol, il a été démontré que la mycobactérie peut être ubiquitinilée et cela permettrait son adressage dans une structure de type autophagolysosomale, cependant dépourvue des marqueurs d’autophagie ATG5 et LC3. Ces absences pourraient être dues à un problème de cinétique car ces marqueurs disparaissent dans l’autophagosome mature (Collins et al., 2009). Cette étape d’ubiquitination pourrait être un facteur d’adressage afin d’induire la dégradation des mycobactéries cytoplasmiques mais reste encore très peu décrite.
Enfin le rôle de ces facteurs associés à l’autophagie dans la mise en place de la réponse anti- mycobactérienne est renforcé par le rôle de l’autophagie dans l’efficacité du BCG et des souches vaccinales dérivées d’H37Rv (Jagannath et al., 2009), l’induction de l’autophagie permettant une meilleure présentation d’antigènes spécifique par les cellules dendritique et permettant une meilleure induction de la réponse lymphocytaire contre, Ag85 par exemple. Cela implique que l’autophagie dans le cas de l’infection par M. tuberculosis joue un rôle important dans la présentation d’antigène à la surface des celles présentatrices et dans l’induction de la réponse adaptative. L’autophagie et son induction sont des facteurs à prendre en compte dans les thérapies vaccinales ; ainsi la co-incubation avec des ligands TLR4 activant ce processus favoriserait l’établissement d’une réponse protectrice (Jagannath et al., 2009; Xu et al., 2007).
- 56 - Il apparaît donc que l’autophagie dans ses formes induite soit un moyen de défense de la cellule-hôte contre l’infection par M. tuberculosis. Actuellement il n’a pas été mis en évidence de moyen d’inhibition par la mycobactérie de ce processus bactériolytique, cependant il est raisonnable d’imaginer que la mycobactérie puisse contrôler ces événement de la même manière que la phagocytose notamment en influent sur la PI3-kinase.
(4) L’apoptose
L’apoptose est un moyen de lutte très efficace contre les pathogènes intracellulaires. Ce programme de mort cellulaire peut être activé soit par la voie intrinsèque soit par la voie extrinsèque qui toutes deux induisent la voie des caspases afin de procéder à l’empaquetage des constituant cellulaire et la fragmentation de l’ADN. La voie intrinsèque implique la translocation du cytochrome-C des mitochondries dans le cytosol tandis que la voie extrinsèque est induite en réponse à des interactions entre des ligands et des récepteurs. Le TNF peut interagir de manière autocrine ou paracrine, avec les recepteurs FAS (Death receptors) et induire ce processus. La mort cellulaire programmée se manifeste par la formation de structures membranaires autour de composants intracellulaires, appelés corps apoptotiques. Ils sont relargués puis phagocytés par les phagocytes environnants dans un contexte non-inflammatoire. Ces corps apoptotiques, une fois internalisés par les DCs, permettent d’induire une réponse adaptative efficace, ces CPAs pouvant présenter à la fois des peptides et des lipides sur leur CMH I-II et CDI pour induire une réponse lymphocytaire (Winau et al., 2006).
M. tuberculosis, contrairement aux mycobactéries non-pathogènes, peut inhiber l’apoptose. Le bacille peut se multiplier sans que les cellules ne puissent répondre de manière efficace aux stimuli de mort cellulaire programmée intrinsèque (lié à l’accumulation de facteurs de stress) ou extrinsèque (induite par des régulations autocrines). Contrairement à d’autres pathogènes tels C. trachomatis la mort cellulaire programmée n’est pas totalement inhibée par le bacille (Fan et al., 1998) ; (Briken and Miller, 2008). Les souches pathogènes répriment partiellement l’induction de l’apoptose (Briken and Miller, 2008; Velmurugan et al., 2007). Les formes néfastes ont une activité parasitaire cytotoxique pour la cellule hôte. Elles induisent nécrose leur plutôt que l’apoptose ce qui favorise leur dissémination à d’autres cellules, à d’autres compartiments de l’organisme hôte et cela augmente les interactions avec le système immunitaire afin d’établir un environnement pro-inflammatoire (Gan et al., 2008). M. tuberculosis (H37Rv) peut inhiber la voie intrinsèque liée à la production de NO et d’ions superoxyde (ROI et RNI). Trois gènes de M. tuberculosis sont essentiels pour inhiber
- 57 - l’apoptose. Le gène nuoG code pour une NADH deshydrogènase de type I, sec2A code pour un transporteur permettant la sécrétion de SodA, une superoxyde dismutase qui transforme les ions superoxydes en H2O2, et enfin une sérine-thréonine kinase membranaire, PknE, qui est
fortement activée par l’accumulation de NO. La délétion de l’un de ces gènes entraîne la perte de la capacité à inhiber l’apoptose (Briken and Miller, 2008; Hinchey et al., 2007; Jayakumar, Jacobs, and Narayanan, 2008). M. tuberculosis induit une désensibilisation des cellules-hôtes aux facteurs d’induction extrinsèques. Des cellules infectées par des souches virulentes sont moins sensibles à l’induction de l’apoptose via des interactions entre TNF et TNF-R1 (Keane et al., 1997). De plus, le bacille inhibe les interactions entre FAS et FAS-ligand en diminuant l’expression de FAS (CD95) à la surface des cellules (Oddo et al., 1998). Grâce à des interactions entre TLR2 et le lipoglycane de M. tuberculosis, NF-κB induit la protéine FLIP qui est aussi un facteur anti-apoptotique (Loeuillet et al., 2006). Par ailleurs, la bactérie induit la synthèse de la forme soluble du TNF-R qui chélate le TNF et empêche son interaction avec son récepteur membranaire (Balcewicz-Sablinska et al., 1998; Fratazzi et al., 1999).
Enfin la multiplication massive des bacilles induit des lésions membranaires dans la cellule hôte, or la perte d’intégrité de la membrane cellulaire est un facteur essentiel d’induction de l’apoptose. M. tuberculosis, en dérégulant la synthèse de PGE2, empêche le maintien de la membrane cellulaire et en inhibant la formation de l’enveloppe apoptotique nécessaire à ce phénomène (Gan et al., 2008) il favorise la mort cellulaire par nécrose plutôt que par apoptose (Divangahi et al., 2009). Des formes virulentes du bacille induisent la surexpression de gènes anti-apoptotiques dans la cellule hôte tels que mcl-1 et A1 (Dhiman et al., 2008; Kausalya et al., 2001; Kremer et al., 1997; Sly et al., 2003). Une autre protéine anti-apoptotique est aussi activée : Bcl-w (Spira et al., 2003). Enfin un facteur pro-apototique Bad, est inactivé par phosphorylation induisant la séquestration du cytochrome-C au niveau des mitochondries (Koul et al., 2004; Maiti, Bhattacharyya, and Basu, 2001).
Un des facteurs limitant de l’activation de l’apoptose chez des macrophages infectés par M. tuberculosis est leur capacité à sécréter du TNF ou à répondre à l’induction par le TNF (Gan et al., 2008) l). Le TNF tout comme l’IFNγ sont des régulateurs de l’activation des macrophages qui sont sécrétés en grande quantité lors de l’infection.
b) Le macrophage activé
Nous avons vu que M. tuberculosis est un pathogène intracellulaire facultatif qui peut persister dans les cellules phagocytaires. Cependant le bacille est sensible à l’activation de nombreux processus bactéricides. Ainsi, l’activation autocrine ou paracrine des phagocytes
Figure 19│Interactions de M. tuberculosis avec le phagolysosome de macrophages activés.