Cellules THP1 et THP1-DC-SIGN infectées par M tuberculosis (+ Mtb) à une MOI de 5 bactéries par

cellules. Après 4h les surnageants ont été prélevés leur composition en cytokines et chimiokines ont été analysés par une technique de macro-array protéique (RayBiotech). Les rectangles rouges repésentent les spots du TNF. B- Analyse densitomètrique des spots de TNF des cellules THP1 (blanc) et THP1-DC-SIGN (gris) après 4h et 18h d’infection. C- Quantification du TNF contenu dans les surnageants des cellules THP1 (blanc) et THP1-DC-SIGN (gris) après infection par M.tuberculosis pendant 4 et 18h.

THP1 THP1 DC-SIGN Ctrl + Mtb (18 h)

A

B

- 122 - l’infection certains sont inhibés dans les THP1-DC-SIGN infectés. Certains de ces gènes peuvent participer à la réponse antibactérienne tels que les chimiokines IP10 (CXCL10) et IP9 (CXCL11). IP10 est fortement induite chez les individus infectés et fait partie des candidats pour être un biomarqueur de l’évolution de l’infection et de l’état de latence dans les formes de tuberculose infantile (Lighter et al., 2009). De plus cette chimiokine est un facteur impliqué dans la mise en place de la réponse lymphocytaire chez la souris (Algood et al., 2004). IP9 et IP10 sont des facteurs critiques de la mise en place de la réponse Th1 (Lande et al., 2003) et leur inhibition lors de l’interaction du bacille avec DC-SIGN peut témoigner du possible rôle de DC-SIGN dans l’échappement du bacille à la réponse immunitaire. De la même manière, NCF1 qui code pour une des sous-unités de la NADPH oxydase est lui aussi inhibé dans les cellules surexprimant la lectine. NCF1 (p47Phox) joue un rôle dans la régulation de l’activation du choc oxydatif dans les macrophages (Inanami et al., 1998; Pinel- Marie et al., 2009) et son inhibition est donc en faveur de la survie du bacille. Un autre candidat intéressant est l’azurocidine dont l’expression est inhibée au cours de l’infection dans les THP1-DC-SIGN alors qu’il n’y a pas de variation dans les cellules contrôles. Cette protéine code pour un peptide antimicrobien qui pourrait permettre de lutter contre M. tuberculosis; son inhibition via DC-SIGN renforce l’hypothèse selon laquelle ce récepteur permet l’échappement immunitaire du bacille. Parmi les gènes activés par le bacille lors de son interaction avec DC-SIGN, le transcriptome confirme une forte activation de l’IL6.

Afin de pouvoir éventuellement définir si les cellules THP1-DC-SIGN permettent plutôt d’induire une réponse pro-Th1 ou pro-Th2 lors de l’infection in vitro par M. tuberculosis nous avons par la suite envisagé une autre approche. Celle-ci est basée sur une étude « protéomique » semi-quantitative du pool de cytokines excrétées dans le surnageant des cellules infectées. Cette approche a permis de mettre en évidence que certains facteurs pro- inflammatoires semblent être préférentiellement sécrétés lors de l’interaction du bacille avec DC-SIGN. Ainsi les cellules surexprimant cette lectine produisent plus de TNF, d’IL1β mais aussi de MCP1 alors que la sécrétion d’IL10 n’est pas induite (Figure 35). Ces résultats sont paradoxallement plutôt en faveur d’un rôle pro-inflammatoire et donc d’une fonction protectrice de DC-SIGN dans l’infection par M. tuberculosis.

Cependant ce modèle présente des limites qui sont certainement à l’origine de la difficulté d’interprétation des résultats. Les cellules THP1 contrôles induisent DC-SIGN en réponse au bacille ce qui ne permet pas de réaliser une comparaison stricte entre des cellules exprimant et

- 123 - n’exprimant pas la lectine. De plus ces cellules sont activées par la PMA ce qui pourrait interférer avec des modulations spécifiques de DC-SIGN.

Une alternative à l’utilisation de lignées cellulaires est l’utilisation de cellules primaires telles que des progéniteurs sanguins obtenus à partir de donneurs. Ces cellules pourront permettre d’étudier le rôle de la lectine dans des DCs et des MPs dérivés de progéniteurs circulants en inhibant la lectine ainsi que des candidats de sa voix de signalisation par des techniques d’interférence ARN dans des systèmes lentiviraux ou bien par l’utilisation de système de transfection tels que la nucléofection. De même ces systèmes pourront permettre d’étudier les possibles interactions avec les autres PRRs tels que les TLR2, 4, 9, et les NLRs. Cette approche permettra aussi de mieux apprécier les interactions avec d’autres lectines tels que la dectine-1 et le MR en les inhibant et en étudiant la réponse des cellules en présence ou en absence du pool de PRR à la surface de la cellule. De meme en complément de l’utilisation de lignées cellulaires telles que des HEK293 sur-exprimant BCL10 et CARD9 les techniques d’inhibition dans les cellules primaires pourraient permettre d’évaluer si DC-SIGN recrute ces partenaires pour transduire son signal.

Enfin, afin de pouvoir mieux apprécier le rôle de cette lectine dans les poumons au cours de l’infection chez l’homme, il serait interessant de cartographier son expression dans les lésions tuberculeuses, et d’étudier son rôle dans les MPs alvéolaires humains de patients atteints de tuberculose ou non, et de comparer les profils cytokiniques après stimulation par le bacille ou des ligands spécifiques.

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Conclusion

La tuberculose est à l’heure actuelle avec le SIDA et le paludisme l’une des trois principales causes de mortalité due à une infection. De part l’émergence de nouvelles souches résistantes aux traitements courants et l’impact de la co-infection avec le VIH, cette pathologie est actuellement en pleine recrudescence. L’inefficacité relative du vaccin commun et les difficultés de détection de la maladie ne permettent pas actuellement de pouvoir en envisager une éradication rapide. Dès lors il apparaît comme essentiel de mieux comprendre les différentes étapes qui conduisent à l’établissement de l’infection et au développement de la pathologie pour pouvoir identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, de nouveaux marqueurs, des nouveaux candidats vaccins ou des nouvelles cibles d’adjuvants afin de pouvoir améliorer les stratégies de soins et de prévention actuelles.

Au cours de ma thèse mon travail a eu pour but d’étudier le rôle de DC-SIGN, un des récepteurs majeurs du bacille à la surface des DCs et des macrophages alvéolaires de patients atteints de tuberculose (Tailleux et al., 2005; Tailleux et al., 2003b). Afin de mieux comprendre les fonctions de cette lectine de type C, nous avons utilisé un nouveau modèle d’étude in vivo chez la souris en essayant de caractériser un homologue fonctionnel de DC- SIGN et en mettant en place des stratégies d’inactivation et des modèles d’étude in vitro. Ainsi nous avons démontré que parmi les sept homologues putatifs de DC-SIGN chez la souris, seul SIGNR3 semble pouvoir être l’analogue fonctionnel de la forme humaine dans le contexte d’infection par le bacille (Tanne et al., 2009). Nous avons pu mettre en évidence que SIGNR3 interagit de manière spécifique avec le bacille et des composés purifiés de l’enveloppe mycobactérienne décrits pour leur fort pouvoir immunogène et leur rôle dans la régulation des processus infectieux. SIGNR3, de manière analogue à la forme humaine, est une lectine de type C qui possède une capacité endocytaire de même qu’une capacité à transduire des signaux après son activation. Alors que l’inactivation des lectines SIGNR1 et SIGNR5 chez des souris C57BL/6 n’influe pas sur le développement de l’infection, SIGNR3 contribue à la protection contre le pathogène. SIGNR3 est induit au cours de l’infection dans les poumons des souris et nous avons montré qu’il est exprimé à la surface de cellules assimilables à des MPs alvéolaires et des cellules géantes multinuclées de type épithélioïdes. Ces cellules n’étant pas faciles à purifier et n’étant pas encore suffisamment caractérisées nous avons utilisé un système alternatif in vitro pour étudier les interactions entre la

- 125 - mycobactérie et cette lectine. Ainsi nous avons montré que la surexpression de cette lectine dans une lignée de macrophages potentialise la réponse inflammatoire en réponse au bacille et aux ligands purifiés en induisant l’IL6 et le TNF. L’étude de la cascade de signalisation nous a permis de mettre en évidence le rôle de Syk, Raf1, Erk et NF-κB dans la régulation de ces phénomènes in vitro. SIGNR3 peut donc moduler la réponse anti-mycobactérienne de manière autonome mais il peut aussi s’associer à des ligands qui, tel que la 19kDa, peuvent interagir avec le TLR2 et potentialiser la réponse inflammatoire TLR2-dépendante.

Mes travaux ont donc permis d’identifier une nouvelle lectine de type C associée à la réponse immunitaire innée contre M. tuberculosis chez la souris. Comme de nombreuses autres lectines celle-ci transduit son signal grâce à Syk et peut interagir avec d’autre PRRs. Le répertoire de PRRs à la surface des cellules phagocytaires souligne la complexité des interactions entre les microbes et les cellules-hôtes. L’association avec d’autres récepteurs paraît nécessaire pour pouvoir discerner des bactéries commensales et pathogènes et pouvoir ainsi potentialiser une réponse inflammatoire spécifique. L’implication récurrente de Syk dans des cascades de régulation en aval de différents PRRs souligne que cette kinase pourrait être une cible thérapeutique envisageable dans le but d’améliorer la réponse immunitaire contre le bacille.

Mes travaux renforcent les précédents résultats quant au rôle possible de DC-SIGN dans la réponse au bacille. Cependant l’ensemble des résultats que j’ai obtenu provient du modèle murin d’infection par le bacille. Ce modèle, comme tous les modèles expérimentaux, présente des limites qui ne nous permettent pas d’extrapoler nos résultats à la tuberculose humaine. Effectivement les souris bien que massivement utilisées dans la recherche contre la tuberculose ne sont pas initialement des réservoirs de ce pathogène et ne présentent pas la même susceptibilité à l’infection que l’homme, les primates, les cobayes ou les lapins (Dharmadhikari and Nardell, 2008; Gupta and Katoch, 2005; McMurray, 2001). Les souris sont résistantes à de fortes doses de bacilles, elles ne développent pas de pathologie granulomateuse caséeuse et plutôt que de contenir le développement des mycobactéries à un niveau pouvant correspondre à des formes latentes d’infection, les souris présentent une forme infectieuse chronique à forte charge bactérienne. Au cours de cette phase le système immunitaire détruit progressivement les tissus en parallèle d’une croissance progressive des mycobactéries, ce qui aboutit à la mort de la souris. (Rhoades, Frank, and Orme, 1997). Durant la phase de croissance stationnaire, les souris contrôlent la multiplication intracellulaire du bacille dans des macrophages faiblement activés en les détruisant sans altérer de manière significative les tissus périphériques. Avant les phases tardives de

- 126 - l’infection il n’y a que très peu de nécrose dans les poumons. Bien qu’elle développe une pathologie différente de la forme humaine la souris reste un modèle reconnu pour l’étude de la mise en place de la réponse immunitaire innée et adaptative contre le bacille de même que pour de nombreuses études pharmacologiques. Nos résultats ont été obtenus grâce à un modèle d’infection à haute dose en intranasal (1000 CFU à J1) et doivent être confirmés dans un modèle moins invasif et plus proche de la réalité qui consiste à infecter les souris par nébulisation avec seulement 75-100 bacilles voire moins.

Afin de pouvoir évaluer la pertinence de notre modèle, nous avons essayé de le comparer à un modèle d’étude in vitro du rôle de la forme humaine de DC-SIGN. Ces études préliminaires semblent pouvoir montrer que DC-SIGN peut à la fois activer et inhiber des facteurs pro- inflammatoires. Il n’est donc pas actuellement possible de conclure à un réel effet bénéfique de ces interactions pour le bacille ou pour l’hôte.

De nombreux aspects de nos observations doivent être validés chez l’homme. Il pourrait être intéressant de mieux documenter l’effet des mutations ponctuelles dans le promoteur du gène codant pour DC-SIGN (Barreiro et al., 2006) in vivo. Cela pourrait être réalisé, à l’aide de lavages broncho-alvéolaires de donneurs génotypés afin d’évaluer si les différents SNPs recensés ont un effet sur le profil d’expression de DC-SIGN, ou s’ils induisent une modulation différentielle de la réponse inflammatoire au cours de l’infection. L’identification de MPs alvéolaires exprimant DC-SIGN à des niveaux variables pourrait permettre d’étudier le profil cytokinique induit ex vivo par le bacille selon la quantité de lectine exprimée. On peut aussi envisager de mettre au point des systèmes d’inhibition dans des cellules primaires humaine. Il pourrait être intéressant de comparer des MPs alvéolaires sauvages à des MPs alvéolaires inhibés pour différents PRRs (TLR2, TLR4, DC-SIGN, dectine-1) permettant ainsi de pouvoir disséquer le rôle spécifique de chaque PRRs in vivo. Enfin la cartographie d’expression de DC-SIGN au cours des tuberculoses latentes dans les lésions est inconnue et on peut s’attendre à ce que les monocytes circulant recrutés au niveau des lésions expriment de manière croissante la lectine en fonction de leur proximité avec les centres nécrotiques où il y a potentiellement une forte densité d’antigènes mycobactériens.

En résumé bien que de nombreuses expériences restent à réaliser pour enrichir nos travaux, nous avons pu identifier et montrer pour la première fois qu’un des homologues murins de DC-SIGN est impliqué dans la résistance à M. tuberculosis in vivo. La découverte de ce récepteur qui interagit avec de nombreux autres pathogènes et de son profil d’expression pulmonaire ouvre la porte à d’autres modèles d’études tels que pour des virus aéroportés. De

- 127 - plus ce profil d’expression au niveau de phagocytes pulmonaires au cours de l’infection ainsi que le fait qu’il reconnaisse les mêmes ligands que la forme humaine fait de la souris et de la lignée SIGNR3-/- un possible modèle d’étude d’adressage spécifique de molécules via DC- SIGN.

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