H5N1 THP1 :: DC-SIGN, DCs
A. Généralités sur le complexe SIGN murin
1.
Le locus DC-SIGN chez la souris est composé de sept gènes SIGNR1-5 (CD209 b,c,d,e,a) , SIGNR7-8 (CD209g et f) et un pseudogène SIGNR6 (CD209h) (Park et al., 2001; Powlesland et al., 2006). Tout comme sur le chromosome 19 humain, ces gènes sont localisés dans une région adjacente à celle des gènes codant pour le CD23 et la LSECtin sur le chromosome 8 murin (Figure 28A). Tous sauf SIGNR2 codent pour des lectines de type C transmembranaires qui présentent à leur extrémité C-terminale un domaine de reconnaissance des carbohydrates (CRD) (Figure 28B). Elles diffèrent significativement de la forme humaine de part leurs régions charnière qui sont beaucoup plus courtes (Powlesland et al., 2006). L’analyse de leur profil d’expression démontre que SIGNR5 (mDC-SIGN ou CIRE) est majoritairement exprimés par des sous-populations de DCs spléniques, des cellules myéloïdes dérivées de moëlle osseuse et des DCs plasmocytoïdes alors qu’elle ne semble pas être exprimée dans les lignées lymphoïdes (Caminschi et al., 2006). Le gène SIGNR5 semble avoir un profil d’expression tissu-spécifique et a été décrit dans les reins, les poumons et la rate; ce fut la première forme prédite comme étant l’orthologue fonctionnel de la forme humaine de part son profil d’expression dans les cellules dendritiques d’où son appelation d’origine : mDC-SIGN (Park et al., 2001). Cependant des analyses plus approfondies ont permis de mettre en évidence que cet homologue murin diffère fonctionnellement de la forme humaine (Caminschi et al., 2006; Gramberg et al., 2006; Powlesland et al., 2006). A la surface des cellules, il est exprimé sous forme monomérique et il est réprimé après activation des DCs (Caminschi et al., 2006; Gramberg et al., 2006). Son CRD présente des profils d’interactions totalement différents de la forme humaine; il reconnaît préférentiellement des radicaux mannose de manière analogue à DC-SIGN-R (Powlesland et al., 2006). SIGNR7 et SIGNR8 sont exprimés dans de nombreux tissus (Powlesland et al., 2006). SIGRN8 tout comme SIGNR5 présente un profil d’interaction différent de la forme humaine, alors que SIGNR7 peut reconnaître des motifs fucosylés et mannosylés. Cependant, SIGNR7 présente un profil d’interaction proche des Siglec et de la Languérine ce qui le différencie du DC-SIGN humain (Powlesland et al., 2006).
- 89 - L’étude comparative de la séquence d’acides aminés et la reconstruction phylogénétique de ce complexe démontre que les lectines SIGNR1, SIGNR3 et SIGNR4 (Figure S1c de la publication) sont les homologues les plus conservés par rapport à la forme humaine (Parent et al., 2002; Powlesland et al., 2006). Chez l’homme la valine 351 et la lysine 368 sont essentielles pour permettre à DC-SIGN de pouvoir à la fois interagir avec des composés mannosylés et des composés fucosylés, ce qui lui confère sa dualité fonctionnelle caractéristique (Guo et al., 2004). Les seules formes murines présentant ces deux sites d’interactions sont SIGNR3 et SIGNR4. Cependant SIGNR4 qui est exprimé exclusivement dans les testicules (Park et al., 2001) ne reconnaît aucun motif glycosylé in vitro (Powlesland et al., 2006). Cette incapacité à interagir avec les sucres est sans doute due à l’absence des acides aminés Glu347 et Glu354 qui sont essentiels pour lier les ions Ca2+ qui permettent la liaison des ligands de ce récepteur.
SIGNR1 ne présente pas de domaine secondaire de liaison au niveau de son CRD, ce qui le différencie de la forme humaine. L’étude des profils d’interaction avec des motifs glycosylés démontre que SIGNR1 et DC-SIGN interagissent de manière spécifique avec des résidus mannosylés (Geijtenbeek et al., 2002), cependant la forme murine reconnaît des résidus mannoses terminaux plutôt que de longues ramifications de mannoses branchés entre eux. Cette propriété d’interaction est commune à d’autres CTL telles que la MBL (Powlesland et al., 2006). SIGNR1 est majoritairement exprimée à la surface des macrophages de la zone marginale de la rate, dans la zone médullaire des ganglions lymphatiques, à la membrane des macrophages péritonéaux résidents et aussi à la surface des cellules microgliales (Geijtenbeek et al., 2002; Kang et al., 2003; Park et al., 2009). Certaines publications décrivent de manière contradictoire sa possible expression à la surface des DCs dérivées de progéniteurs médullaires (Srivastava et al., 2009; Wethmar et al., 2006). Ce récepteur membranaire se présente sous forme agrégée à la surface des cellules in vivo (Kang et al., 2003), grâce à son domaine fonctionnel il peut interagir avec de nombreux pathogènes. In vitro cette lectine interagit avec peu de motifs sucrés purifiés et elle reconnaît préférentiellement de forte densités de motifs glycosylés tels que ceux pouvant être présents à la surface de bactéries ou de parasites (Powlesland et al., 2006).
SIGNR3 présente quant à lui un profil d’interaction différent de celui de SIGNR1 et SIGNR5 mais analogue à celui la forme humaine de DC-SIGN. Elle est la seule des sept isoformes murines à présenter une réelle dualité d’interaction avec des motifs mannosylés et des motifs fucosylés dont l’antigène de Lewisx (Powlesland et al., 2006). De plus elle est la seule à pouvoir s’oligomériser bien que la petite taille de sa région intermédiaire ne lui permette pas
- 90 - de mettre en place des interactions aussi stables que celles de la forme humaine (Powlesland et al., 2006). Elle possède deux motifs d’internalisation putatifs dans sa région intra- cytoplasmique: un motif di-leucine LL et un motif YXXL. Ces deux motifs lui confèrent une forte capacité d’endocytose qui est largement supérieure à celle de SIGNR1 et SIGNR5 (Takahara et al., 2004) et permettent l’adressage des complexes ligands-récepteurs à des compartiments endosomaux (TFNR+ LAMP2-) (Takahara et al., 2004). De plus SIGNR3 présente la capacité de pouvoir de plus libérer ses ligands à des valeurs de pH analogues à celles de la forme humaine et correspondant à celui des endosomes permettant ainsi le recyclage des récepteurs à la membrane (Powlesland et al., 2006; Takahara et al., 2004).
a) Interactions avec des motifs endogènes
Les formes murines les plus étudiées fonctionnellement sont SIGNR5, SIGNR1 et SIGNR3. Dans une première étude Wethmar et collaborateur évaluèrent le rôle de ces CTL dans les phénomènes de transmigration des DCs (Wethmar et al., 2006). Alors que chez l’homme DC- SIGN est impliqué dans la migration trans-endothéliale des DCs en interagissant avec ICAM- 2 (Geijtenbeek et al., 2000a), chez la souris, ces évènements, bien que dépendants de cette glycoprotéine membranaire, sont indépendants de SIGNR1-3-5 qui ne sont pas exprimées à la surface des DCs tissulaire dans des conditions non-infectieuses (Wethmar et al., 2006). Cependant le rôle des autres lectines du complexe DC-SIGN dans ces conditions n’a pas été évalué de même que la fonction de ces lectines dans des évènements de recrutement au cours de processus infectieux reste encore inconnue.
Contrairemant à a forme humaine qui lie ICAM3 à la surface des lymphocytes pour stabiliser la synapse immunologique entre les DCs et les LTs (Geijtenbeek et al., 2000c), il semble que les SIGNRs de souris ne puissent jouer un rôle identique dans les interactions entre les DCs et les lymphocytes via la reconnaissance de cette glycoprotéine membranaire. En effet, l’ICAM3 résulte d’évènement de duplication du gène ancestral codant l’ICAM1 chez un ancêtre commun des mammifères, cependant au cours de l’évolution, ICAM3 semble avoir disparu chez les souris (Sugino,2005). Cependant le rôle de ce complexe dans la mise en place de telles interactions cellulaires reste à évaluer en étudiant de possibles interactions avec d’autres glycoproteines à la surface des cellules murines.
b) Leur rôle de PRRs
Seul SIGNR1 a été décrit comme pouvant intervenir dans la régulation de la réponse immunitaire à des pathogènes. Cette lectine peut interagir in vitro notamment avec des composés de l’enveloppe de bactéries à Gram négatif telles que E. coli et S. typhimurium de
- 91 - même qu’avec des composés de l’enveloppe de C. albicans et de S. mansoni (Saunders et al., 2008; Takahara et al., 2004). In vivo SIGNR-1 semble jouer un rôle critique dans la reconnaissance de composés de la capsule de bactéries à Gram positif telles que S. pneumoniae qui est un agent pathogène majeur (Geijtenbeek et al., 2002; Kang et al., 2004; Kang et al., 2003). Ces interactions entre cette lectine et les composés polysaccharidiques de l’enveloppe de certains sérotypes du pneumocoque et des lysosomes couverts de motifs mannosylés sont dépendantes de la mise en place d’interactions avec des facteurs du complément (C1q, C3) qui permettent l’activation de la voie directe du complément et favorise ainsi la dégradation du pathogène (Kang et al., 2006; Takagi et al., 2009). In vivo, dans les phases de septicémie, SIGNR1 joue un rôle majeur dans la capture de bactéries circulantes au niveau des MPs de la zone marginale (Kang et al., 2004). Son inactivation induit une forte susceptibilité à l’infection par S. pneumoniae (Kagan et al., 2008; Koppel et al., 2005a; Lanoue et al., 2004). Les souris SIGNR1-/- présentent une réponse inflammatoire exacerbée et ne parviennent pas à produire rapidement des IgM. Deux hypothèses furent émises afin d’expliquer ce phénotype ; selon Koppel et collaborateurs. SIGNR1 capture les bactéries au niveau des MPs de la zone marginale et favorise la présentation d’antigènes permettant ainsi l’activation d’une réponse lymphocytaire de type B et la synthèse d’IgM spécifiques (Koppel et al., 2005c). Selon Lannoue et collaborateurs, SIGNR1 participe à l’élimination des bactéries et à un contrôle de la septicémie de manière indépendante de la régulation de la synthèse d’IgM (Lanoue et al., 2004). Cette seconde hypothèse fut récemment démontrée car la production d’IgM circulants contre certains antigènes bactériens n’est pas altérée par l’inactivation de SIGNR1 (Moens et al., 2007). Chez l’homme S. pneumoniae est à l’origine de pneumonies mais aussi de méningites. L’étude des modèles rongeurs (souris et rat) de méningite à pneumocoques a permis de démontrer l’expression SIGNR1 (RnCD209b chez le rat) à la surface de phagocytes tissulaires, les cellules microgliales, ce qui lui confère un rôle majeur dans la contrôle du devenir de la pathologie (Park et al., 2009).
Bien qu’il puisse interagir in vitro avec S. mansoni l’étude de la susceptibilité des souris inactivée pour SIGNR1 n’a pas permis de mettre en évidence de fonction protectrice de cette lectine contre ce pathogène in vivo (Saunders et al., 2009).
In vitro SIGNR1 peut aussi interagir avec TLR4 pour moduler la réponse contre des composés constituant l’enveloppe de bactérie à Gram négatif tels que le LPS, ce qui favorise l’induction de la voie de transduction en aval de TLR4 et la sécrétion de cytokines pro- inflammatoires telless que l’IL6, MCP1 et le TNF (Nagaoka et al., 2005). De même, une étude récente a permis de mettre en évidence que cette lectine est localisée au niveau des
Figure 29│SIGNR3 est Induit pendant les phases précoces de l’infection
Des souris C57BL/6 ont été infectées par voie intranasale avec 1000 CFU de M. tuberculosis H37Rv. A différents points de la cinétique les souris ont été sacrifiées et les poumons et les rates ont été prélevés. Après homogénéisation de ces organes les ARN totaux ont été purifiés puis des RT-PCR quantitatives ont été réalisées grâce à des sondes TaqMan ® pour les gènes SIGNR3-5-1 et pour l’endogène HPRT. Les résultats représentent une quantification relative normalisée par rapport à l’endogène puis par rapport au jours O de l’évolution de la quantité de transcrit de ces différents gènes dans des pools d’ARN correspondant à au moins 3 animaux par point. Adapté des résultats obtenus au cours de mon DEA.
0,1 1 10 100
1000 SIGNR-1 SIGNR-3 SIGNR-5
0 1 7 21 42
Jours après l’infection
Q uan tif icati on relati ve (2 Ct) / JO
- 92 - radeaux lipidiques et que l’activation de SIGNR1 par un anticorps spécifique induit la sécrétion de TNF de manière dépendante de la cascade JNK et indépendante des voix ERK et p38MAPK (Numazaki et al., 2009).
c) Etude du rôle du complexe murin dans l’infection par M.
tuberculosis.
Initialement afin d’évaluer les rôles de ce complexe dans le modèle murin de tuberculose nous avons envisagé d’étudier par RT-PCR quantitative la régulation de cinq des septs isoformes murines (SIGNR1-5) au cours de l’infection par M. tuberculosis H37Rv. Nous avons ainsi infecté des souris C57BL/6 par voie intranasale avec 1000 CFUs et nous avons pu observer par quantification relative que les paralogues SIGNR1, SIGNR3 et SIGNR5 semblaient être les plus modulés pendant les phases précoces de l’infection au niveau des poumons (Figure 29). De plus nous avons pu constater que SIGNR3 et SIGNR5 étaient exprimés dans les cellules CD11c+ spléniques et pulmonaires qui regroupent les DCs et les MPs alvéolaires. SIGNR1 quant à lui semblait majoritairement exprimé dans les organes lymphoïdes primaires et secondaires. Dans la rate, SIGNR1 n’est pas significativement exprimé par les cellules CD11c+, les cellules spléniques exprimant majoritairement cette lectine étant les MPs de la zone marginale qui sont des cellules CD11c- CD11b+ Marco+ CD169+ F4/80+ (Kang et al., 2003).
Ces résultats préliminaires obtenus au cours de mon DEA, nous ont conduit à focaliser notre travail sur une étude comparative du rôle de SIGNR1, SIGNR3 et SIGNR5 au cours de l’infection par M. tuberculosis et à caractériser le rôle des ces lectines dans un modèle de macrophages afin de pouvoir évaluer le rôle de DC-SIGN chez l’homme lorsqu’il est induit à la surface des macrophages alvéolaires au cours de l’infection (Tailleux et al., 2005).
Différentes stratégies ont dès lors étaient envisagées afin d’inhiber l’expression de ces lectines in vivo. Dans un premier temps nous avons mis au point des vecteurs lentiviraux afin de pouvoir mettre en place une inhibition constitutive partielle de ces lectines par interférence à ARN (RNAi) (Dann, 2007; Frka et al., 2009; Mello and Conte, 2004; Pfeifer, 2004; Rockett et al., 1998; Xia, Zhou, and Xu, 2006). Cette méthode d’inhibition consiste à prélever des zygotes après fécondation, à les transduire avec les particules lentivirales puis à les réimplanter dans des mères porteuses afin de permettre le développement des embryons transgéniques. L’utilisation de vecteurs exprimant la GFP devait nous permettre de pouvoir rapidement cribler les animaux transgéniques obtenus. Bien que prometteuse car engagée jusqu’au stade de validation des portées F0 transgéniques, cette méthodologie a été
- 93 - abandonnée au profit d’une autre alternative. En effet nous avons eu accès à des animaux inactivés dans les trois lectines (Figures S3, S4, S5 de la publication) dans le fond génétique C57BL/6 qui sont des souris résistantes à l’infection (Medina and North, 1998; Winslow et al., 2008). De plus ces souris KO ne présentant pas de phénotypes développementaux particuliers et garantissant une extinction totale des gènes présentaient un avantage non négligeable par rapport aux modèles de Knock-down par « short hairpin RNA » qui peuvent présenter des niveaux d’inhibition variables et nécessiter une longue phase d’analyse avant d’isoler les individus permettant de créer une colonie.
Ainsi mes travaux de thèse se sont basés sur l’étude comparative de ces trois lectines et plus particulièrement sur l’étude comparative des phénotypes obtenus lors de l’infection de ces trois génotypes (SIGNR1-/-, SIGNR3-/- et SIGNR5-/-) en comparaison avec des souris sauvage C57BL/6.