inductible (iNOS), des chélateurs et exporteurs de fer tels que la lactoferrine et NRAMP-1 (natural resistance-associated macrophage protein 1). De plus le phagolysosome contient un grand nombre de peptides antimicrobiens tels que la cathélicidine D , la lipocaline et des défensines qui favorisent la bactéricidie. L’accumulation de radicaux libres (ROS) contribue à l’oxydation et la dégradation des acides nucléiques et des protéines de la bactéries. B- M. tuberculosis parvient à persister partiellement dans les macrophages activés, la modification de la composition lipidique de son enveloppe peut inhiber les interactions avec les peptides antimicrobiens. L’expression de la catalase, KatG, lui permet de convertir les radicaux libres en composés moins toxiques. CysH, SodA-C et des réductases inhibent l’accumulation de ces radicaux libres. De plus le bacille parvient à inhiber l’accumulation d’ions H+et résiste à l’acidification du compartiment grâce à la protéine Rv3671c. Grâce à son système de sécrétion codé par le complexe RD1 il peut excréter des facteurs de résistance dans le compartiment phagolysosomal. Enfin il semble que ce complexe soit dans le cas de M. marinum nécessaire pour l’ échappement du bacille dans le cytoplasme Cependant concernant M. tuberculosis cette hypothèse est encore discutée. Adapté de Flannagan et al,
2009. PI3P NRAMP-1 V-ATPase ESX1 Sidérophore Peptides antimicrobiens Lipocaline O2- Defensine Proteases Fe2+ Fe2+ O2- O2- H+ H+ H+ Citruline Arginine NO ONOO- NO2 HO H202 2H20 + 02 2H202 KatG H+ NADPH oxydase NADP + O2- NADPH H+ Cathelicidine D NO2 HO Fe2+ Fe2+ Fe2+ A Fonctions bactéricides B Systèmes de persistance de M. tuberculosis Echappement Cytoplasmique ? M. tuberculosis H+ Fe2+ H+ H+ H+ SodA-C CysH Reductases ESX1 Rv3671c IRGM1 Lactoferrine
- 58 - via la réponse lymphocytaire par le TNF et l’IFNγ favorise la lyse des bactéries en induisant l’apoptose, la maturation du phagosome et l’autophagie.
(1) L’activation induit la maturation de la vacuole mycobactérienne et l’autophagie
L’activation des macrophages infectés ou l’infection de macrophages activés conduit à un meilleur effet bactéricide. L’IFNγ et le TNF, en interagissant avec leur récepteurs à la surface des cellules phagocytaires, induisent la translocation de petites protéines G (IRGM1, LRG47) depuis l’appareil de Golgi vers la surface des phagosomes (Tiwari et al., 2009). Ces interactions se font grâce à l’induction de la synthèse de phospho-lipides membranaires spécifiques PI(3-4)P2 et PI(3-4-5)P3 par des PI-kinase et des phosphatase à la surface des phagocytes (Tiwari et al., 2009). Ces phospholipides permettent l’ancrage de ces GTPase ainsi que l’induction de la maturation du phagosome mycobactérien en favorisant la fusion avec des lysosomes ou bien en induisant une voix proche de l’autophagie. Cette maturation entraîne un ensemble d’évènements permettant la lyse bactérienne tels que l’acidification, l’interaction avec des ROS, RNS, peptides antimicrobiens et des enzymes lysosomales (Figure 19A). Cependant bien que suite à cette activation la cellule-hôte semble pouvoir déplacer l’équilibre hôte-pathogène en sa faveur, le bacille parvient tout de même à résister partiellement et ne peut être éliminé de l’organisme (Figure 19B)
(2) L’acidification
L’acidification est un des évènements majeurs résultant de la maturation du phagosome. La fusion avec les endosomes et les lysosomes permet l’acquisition d’une pompe à proton ( V- ATPase) qui induit une accumulation progressive de cation H+ dans le phagosome (Figure 19). L’acidification est progressive depuis un pH d’environ 6,2 dans l’endosome précoce jusqu’à un pH d’environ 4,5 qui altère l’intégrité des constituants membranaires des pathogènes endocytés et active certaines enzymes lysosomales. Bien que l’activation du macrophage puisse rétablir cette acidification du phagosome (Sturgill-Koszycki, Schaible, and Russell, 1996; Via et al., 1998) ou induire la formation d’un auto-phagolysosome, l’ensemble des mycobactéries infectant un macrophage activé ne sont pas dégradées (Gomes et al., 1999; Vandal et al., 2008). De plus certains mutants de M. tuberculosis et de BCG qui ne parviennent pas à bloquer la maturation du phagosome en lysosome réussissent à résister dans les macrophages (MacGurn and Cox, 2007; Pethe et al., 2004; Stewart et al., 2005). Cette dégradation partielle implique que les mycobactéries possèdent un système leur permettant de résister en partie au pH acide.
- 59 - Récemment il a pu être mis en évidence qu’un gène mycobactérien, Rv3671c, codant pour une serine-protéase trans-membranaire putative de permet au bacille de réguler son pH interne et qu’en son absence la bactérie ne parvient pas in vitro à résister à des pH acides et est plus sensible au choc oxydatif (Vandal, Nathan, and Ehrt, 2009; Vandal et al., 2008; Vandal et al., 2009). De plus, ce mutant est fortement atténué ex vivo dans des macrophages activés et in vivo dans les souris où il parvient moins bien à établir une infection (Vandal et al., 2008). Puis, lors de la phase secondaire de la réponse immunitaire, l’activation de la réponse lymphocytaire entraîne une forte diminution de la charge bactérienne. La diminution du nombre de CFUs entre les jours 1 et 21 de l’infection implique qu’il y ait une activation de certains macrophages et donc un rôle de l’acidification pendant ces étapes précoces de l’infection. La forte diminution de la bactériémie après l’activation de la réponse adaptative au jour 21 chez la souris est due à la sécrétion d’ IFNγ et à l’activation massive des macrophages liée au développement de l’inflammation (Vandal et al., 2008).
(3) Les ROS (reactiv oxygen species) et RNS (reactiv nitrogen species)
Les phagocytes professionnels peuvent détruire les pathogènes grâce à la production de composés instables dérivés de l’oxygène ou de l’azote (ROS et RNS). Les ROS sont générés directement ou indirectement par une NADPH oxydase qui est recrutée au phagosome dès les étapes précoces de la phagocytose (Figure 19) (Minakami and Sumimotoa, 2006).
Les RNS sont synthétisés grâce à la NO-synthase (iNOS) qui est un système inductible régulé par les PRRs et l’IFNγ . Bien que la synthèse du NO à partir de l’arginine joue un rôle essentiel dans les mécanismes de défense anti-mycobactérienne chez la souris (Chan et al., 1995; Chan et al., 1992; MacMicking et al., 1997), son rôle chez l’homme semble moins évident. L’iNOS est présente dans les macrophages de patients cependant l’activité bactéricide du NO dans la MPs humains n’est pas encore démontrée (Nicholson et al., 1996; Ralph, Kelly, and Anstey, 2008; Rockett et al., 1998; Thoma-Uszynski et al., 2001). Il semble que, bien que l’activité du NO et l’effet bactéricide chez la souris soit régulée par le TLR2 (Brightbill et al., 1999; Chan et al., 1995; MacMicking et al., 1997; Thoma-Uszynski et al., 2001), chez l’homme iNOS ne soit pas régulé par les TLRs et que l’activité bactéricide des macrophages soit indépendante du NO (Thoma-Uszynski et al., 2001).
Dès les étapes précoces de la phagocytose, il y a accumulation d’anions superoxyde (O2-) qui
peuvent se dismuter et former du peroxyde d’hydrogène H2O2 afin de générer des radicaux
- 60 - forment des acides nitreux qui dismutent en monoxyde d’azote NO et en dioxyde d’azote NO2
(Nathan and Shiloh, 2000). Le NO peut interagir avec les ROS produits soit par les macrophages soit par le métabolisme du pathogène pour former des peroxynitrites (Beckman et al., 1990). Les ROI et RNI ont une forte activité bactéricide car ils peuvent réagir avec les acides nucléiques, les protéines, les lipides et les carbohydrates et induire leur dégradation. Les individus présentant des syndromes granulomateux dus à des mutations dans le gène NOX2 codant pour la NADPH oxydase sont très susceptibles à l’infection par le bacille tuberculeux (Bustamante et al., 2007) alors que les souris NOX2 -/- sont résistantes à l’infection.
Cependant M. tuberculosis possède différents systèmes de détoxification lui permettant de résister à l’accumulation de ROI et RNI tels qu’une catalase (KatG), des superoxyde dismutases (SodA, SodC), des enzymes anti-oxydantes (CysH) et des réductases/peroxydases (AhpC, AhpD, DlaT et Lpd) (Figure19) (Ehrt and Schnappinger, 2009).
(4) Les peptides antimicrobiens
Les phagocytes et les cellules épithéliales peuvent synthétiser de petits peptides qui ont des fonctions bactéricides et de régulation de la réponse immunitaire. Ainsi dans les voies aériennes, on retrouve de nombreuses défensines qui sont de petits peptides cationiques pouvant jouer un rôle bactéricide en perméabilisant les membranes et en interagissant avec les constituants bactériens anioniques (Lehrer, Lichtenstein, and Ganz, 1993; Mendez-Samperio, 2008). De plus, ces peptides jouent des rôles immunomodulateurs et chimioattractif de MPs, LTs et autres effecteurs de la réponse immunitaire (Mendez-Samperio, 2008). L’étude des lavages broncho-alvéolaires de patients atteints de tuberculose a mis en évidence une concentration significative de défensines A (Ashitani et al., 2002) et B. Le rôle bactéricide des défensines A sur M. tuberculosis est discutable mais ces peptides semblent être un facteur important dans la réponse des neutrophiles contre l’infection (Ganz, 1987; Kisich et al., 2002). Il semble que les défensines B aient quant à elles un fort pouvoir anti-mycobactérien (Kisich et al., 2002; Sharma, Verma, and Khuller, 1999).
Les cellules de l’épithélium respiratoire produisent aussi un autre peptide antibactérien appelé lipocaline-2 qui est codée par le gène lcn2. Cette protéine est produite par les MPs et les cellules épithéliales. Elle joue de nombreux rôles notamment dans le développement des glandes mammaires, l’apoptose et le transport du fer. Cette sidérocaline peut de plus interagir avec des sidérophores bactériens qui permettent l’importation de fer, un des nutriments essentiels. Elle peut interagir avec des enterobactines (E. coli), des bacillibactines (B.
- 61 - anthracis) et des carboxy-mycobactines (M. tuberculosis) (Abergel et al., 2006; Holmes et al., 2005). Cette protéine, en altérant l’import de fer par des sidérophores bactériens et en séquestrant le fer dans les cellules hôtes, inhibe notamment la croissance d’E. coli. Les souris LCN2 -/- sont susceptibles à l’infection par des colibacilles (Berger et al., 2006; Flo et al., 2004). Les mycobactéries, lors de leur entrée dans les poumons parviennent à infecter les MPs mais aussi les cellules épithéliales. Ces pathogènes intracellulaires possèdent des systèmes enzymatiques leur permettant d’utiliser le fer lié aux protéines de l’hôte pour favoriser leur métabolisme. M. tuberculosis synthétise la mycobactine et la carboxy-mycobactine. Lors de l’infection de souris par voie trachéale, l’expression de Lcn2 est très rapidement induite au niveau des cellules épithéliales et des MPs alvéolaires (Saiga et al., 2008). Alors que dans les cellules épithéliales ce peptide antimicrobien colocalise avec le bacille, il se situe dans des compartiments différents dans les MPs infectés. L’étude des souris LCN2 -/- a permis de mettre en évidence une susceptibilité accrue à M. tuberculosis et une localisation ectopique majeure du bacille que l’on retrouve en grande quantité dans les cellules épithéliales. Il semble que ce peptide ne soit pas essentiel dans le macrophage qui, malgré l’absence de lipocaline-2, contrôle bien l’infection. A l’inverse, les cellules épithéliales de souris inactivées pour ce gène ne parviennent pas à contrôler le développement du bacille. Cette sidérocaline jouerait donc un rôle majeur dans la défense anti-mycobactérienne de la muqueuse respiratoire (Saiga et al., 2008).
L’accumulation dans les phagolysosomes et les auto-phagolysosomes de ces peptides anti- microbiens ainsi que de peptides ubiquitilés joue un rôle très important dans la dégradation du bacille (Alonso et al., 2007). L’interaction entre ces peptides ubiquitylés et le bacille pourrait permettre ou résulter des interactions avec les voies d’autophagie afin d’induire la dégradation du bacille par le macrophage activé (Purdy, Niederweis, and Russell, 2009).
Un troisième peptide antimycobactérien est actuellement très étudié et plus particulièrement ses voies de régulations. La cathelicidine D (LL37) est un puissant peptide anti- mycobactérien mais aussi un important régulateur de la réponse pro-inflamatoire (Liu et al., 2009; Liu et al., 2006). LL37 tout comme celui codant DEFB4 (human β defensin), possède la particularité d’avoir dans ses régions régulatrices des éléments de réponse à la vitamine D (Rivas-Santiago et al., 2008; Wang et al., 2004). Bien que présents chez l’homme, ces éléments régulateurs sont absents des régions régulatrices du gène murin (Wang et al., 2004). La vitamine D (25-hydroxyvitamin-D3) est, sous sa forme active (1,25 dihydroxyvitamin- D3), un important régulateur de la réponse immunitaire anti-mycobactérienne. Elle se lie à son récepteur (VDR pour vitamin D receptor) qui peut moduler l’expression de nombreux
- 62 - gènes. L’inhibition de LL37 dans des monocytes humains entraîne la diminution de l’effet mycobactéricide (Liu et al., 2007). Ce puissant peptide antimicrobien lysosomal joue aussi des rôles de chimioattractant, de régulateur de la réponse inflammatoire, de l’angiogénèse mais aussi de régulateur d’autophagie (Nijnik and Hancock, 2009; Yuk et al., 2009). Il induit la production d’ATG5 et de la becline-1 et permet le recrutement de LC3 et son activation par la PI3K afin d’induire une voie semblable à l’autophagie. Puis l’accumulation de ce peptide antimicrobien induit la maturation de l’autophagosome en autophagolysosome pour permettre la dégradation de la bactérie (Nijnik and Hancock, 2009; Yuk et al., 2009).
Le rôle de la vitamine D semble être très critique pour la résistance à l’infection par le bacille. Dès la fin du 19ème siècle, avant même la découverte de l’agent étiologique, les patients atteints de tuberculose cutanée furent efficacement soignés dans les sanatoriums (Niels Ryberg Finsen, prix Nobel 1903), ce bienfait de l’exposition au soleil pouvant s’expliquer par le caractère inductible de la vitamine D en réponse aux UV-B. De plus plusieurs essais thérapeutique au cours du 20ème siècle ont permis de mettre en évidence les bienfaits de la vitamine D contre les infections par M. tuberculosis (Dowling and Thomas, 1946; Martineau et al., 2007; Morcos et al., 1998; Nursyam, Amin, and Rumende, 2006; Wilkinson et al., 2000). L’activation des macrophages par des ligands TLR1/2 ou NLRs induit la sécrétion de ROIs et de cytokines (IL15/IL1) permettant l’activation d’une α-deshydroxylase, CYP27B1. Cette enzyme permet la conversion de la pro-VitD3 en sa forme active qui peut interagir avec le VDR et moduler certains gènes de la réponse anti-mycobactérienne afin d’induire différents processus tels que l’autophagie (Fabri and Modlin, 2009).
L’importance de la vitamine D dans la réponse à l’infection est mise en évidence par la susceptibilité accrue des personnes à faible taux sérique de Pro-VitD3, notamment des Noirs- Américains qui, du fait de la concentration en mélanine pigmentaire élevée dans leur peau, synthétisent moins de vitamine D en réponse aux UV (Nnoaham and Clarke, 2008). De plus, des associations entre des génotypes spécifiques du VDR, le faible taux sérique et la susceptibilité à la maladie ont pu être mises en évidence (Wilkinson et al., 2000).
- 63 -
3.
a) Régulations de l’équilibre immunitaire
Dynamique de l’infection et mise en place de la réponse adaptative
Les poumons peuvent être divisés en deux compartiments fonctionnels: les voies aériennes et le parenchyme pulmonaire. Ils sont composés de différents types cellulaires contre l’exposition à des pathogènes aéroportés. Les voies aériennes sont tapissées par la muqueuse respiratoire qui est composée de cellules ciliées et de cellules de Goblet (Holt et al., 2008). Ces cellules produisent le mucus qui permet d’évacuer les particules grâce à un processus mécano-cilié. Cet épithélium contient un grand nombre de cellules dendritiques et de macrophage. Les DCs pulmonaires sont pour la majorité d’origine myéloïde et sont spécialisées dans la surveillance et la capture d’antigènes (Jahnsen et al., 2001). Cependant elles ne sont pas initialement capables de jouer un rôle de cellules présentatrices d’antigènes (CPA) (Stumbles et al., 1998). Tout comme leurs homologues dans les intestins, ces cellules peuvent émettre des protrusions dans la lumière des voies respiratoires et y interagir avec des antigènes (Jahnsen et al., 2001; Rescigno et al., 2001). A ces cellules d’origines myéloïdes viennent s’ajouter des mastocytes, des plasmocytes produisant des IgGA, des lymphocytes B et de nombreux lymphocytes T (CD8+ et CD4+) qui ont à la fois des phénotypes effecteurs et mémoires (Holt et al., 2008). Dans certains cas ces cellules peuvent s’organiser sous forme de structures lymphoïdes secondaires appelées BALT (Bronchial Associated Lymphoid Tissue). Elles sont présentes chez les jeunes enfants et les animaux, mais chez l’homme il semble qu’elles soient absentes chez les adultes (Holt et al., 2008; Tschernig and Pabst, 2000; Tschernig and Pabst, 2009). Ces structures sont composées de LBs, LTs, LT régulateurs, de cellules M et de cellules phagocytaires telles que des DCs et MPs. Le rôle de ces structures dans la régulation du développement, de l’homéostasie et de l’activation de la réponse immunitaire n’est actuellement pas bien compris. Cependant il est intéressant de noter qu’elles semblent être présentes chez les personnes susceptibles à la tuberculose telles que les jeunes enfants et les personnes souffrant d’inflammation chronique tels que les fumeurs (Richmond et al., 1993).
Le parenchyme pulmonaire est situé en aval des bronches et des bronchioles et correspond au compartiment alvéolaire délimité par des cellules épithéliales. Il est hautement vascularisé afin de permettre les échanges gazeux. Les cellules immunitaires se situent à la fois dans l’épithélium alvéolaire mais aussi dans la lumière des alvéoles. À l’état normal, ces cellules sont majoritairement représentées (90-95%) par des macrophages alvéolaires qui expriment
- 64 - les marqueurs F4/80, CD11c, et CD11b. Les 10-5% restant sont majoritairement représentés par des LTs (CD103+,γ/δ ou α/β TCR et CD4-/CD8- et des DCs et LBs (Wissinger, Goulding, and Hussell, 2009). Les poumons sont constamment soumis à des stimulations antigéniques, afin de pas être dans un état d’inflammation chronique la réponse immunitaire alvéolaire y est fortement inhibée. L’épithélium respiratoire à l’état de repos exprime un faible niveau de TLR2, TLR9, pas de TLR4, peu de NLR et peu de molécules adaptatrices telle que CD36 (Mayer and Dalpke, 2007). La voie dépendante de MyD88 est très inhibée via l’expression d’inhibiteurs tels que SIGIRR, TOLLIP, IRAK-M dans les cellules épithéliales ce qui limite la capacité de modulation de la réponse inflammatoire. Les cellules de la paroi alvéolaire interagissent étroitement avec les MPs alvéolaires et les maintiennent dans un état désensibilisé (Mayer and Dalpke, 2007; Wissinger, Goulding, and Hussell, 2009). Ces MPs sont inhibés via un système de « Rhéostat » qui régule des interactions inhibitrices entre le TGFβ et l’intégrine αβ6, CD200 et CD200R, l’IL10 et l’IL10R afin de moduler le niveau d’expression des TLRs et des autres PRRs (Mayer and Dalpke, 2007; Wissinger, Goulding, and Hussell, 2009). De plus ces cellules jouent un rôle immunosuppresseur en induisant une forme réversible d’inhibition de la réponse lymphocytaire et/ou une forme de tolérance en produisant des cytokines pro-Th2 (TGFβ et IL10) (Wissinger, Goulding, and Hussell, 2009). Les MPs alvéolaires quiescents ont une faible activité phagocytaire, une faible capacité à présenter les antigènes et expriment peu de molécules de costimulation (Wissinger, Goulding, and Hussell, 2009). Enfin ils inhibent la capacité d’activation des DCs alvéolaires interdigitales en inhibant la sécrétion d’IL12 (Holt et al., 2008). Les DCs alvéolaires contribuent elles aussi à l’homéostasie alvéolaire en sécrétant une grande quantité d’IL10 permettant de limiter la réponse inflammatoire locale (Akbari, DeKruyff, and Umetsu, 2001). La discrimination entre des motifs antigéniques pathogènes et non pathogènes se fait à la surface des cellules de la réponse immunitaire innée (MPs, PMNs, DCs) mais aussi à la surface cellules épithéliales grâce aux PRRs qui permettent de déplacer le rhéostat en position pro-inflammatoire et de répondre à l’infection (Wissinger, Goulding, and Hussell, 2009).
b) L’entré du bacille et sa multiplication
Chez l’homme on considère que l’infection primaire par M. tuberculosis peut s’établir suite à l’inhalation de petites gouttelettes ne contenant qu’un faible nombre de bacilles (une dizaine). La majorité de nos connaissances sur la régulation de la réponse immunitaire depuis l’infection jusqu’à l’établissement de la phase chronique résulte principalement de l’étude du modèle murin d’infection qui emploie des inoculations intranasales (doses élevées de plus de 250 CFUs) ou des systèmes de nébulisation (doses faibles de moins de 200 CFUs). La
Figure 20│L’activation de la réponse immunitaire
A- M. tuberculosis pénètre jusque dans le compartiment alvéolaire ou il interagit avec les cellules