Injection des protéines Flag-R7 ou Flag-R9-TIS11b dans les tumeurs pré-établies

Différentes concentration (50 nM, 75 nM ou 100 nM) dans 15 µL de protéines Flag-R7- ou Flag-R9-TIS11b purifiées (purification décrite dans l’article ci-joint p. 138), ont été injectées dans les tumeurs LL2 pré-établies avant l’apparition à J2 ou à l’apparition de celles-ci, i.e. à J11 toutes les 24 h (50 ou 100 nM) ou 48 h (75 ou 100 nM), versus du tampon (mélange du tampon d’élution des protéines purifiées et de PBS) toutes les 48 h. Les tumeurs ont été mesurées à l’aide d’un pied à coulisse toutes les 24 h. Le volume tumoral a été calculé selon la formule L x l x h. Les moyennes des volumes des tumeurs ont été calculées et reportées en mm3. Les animaux ont été sacrifiés 23 jours post-transplantation. Les tumeurs ont été prélevées et photographiées. Un volume tumoral maximal de 1 cm3 a été respecté.

3.7. Purification des ARNm et Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) semi quantitative

Les ARN totaux de tumeurs ont été purifiés avec le kit RNeasy Mini kit (QIAGEN) selon le protocole du fournisseur. L’analyse semi-quantitative en RT-PCR semi-quantitative de l’expression du VEGF et de l’HPRT (hypoxantine phosphoribosyl transférase) a été réalisée selon le protocole décrit dans l’article ci-joint p.141.

3

ème

_{Partie :}

Phosphorylation de TIS11b par la

protéine kinase A (PKA)

1. Introduction

Le VEGF est le facteur de croissance angiogène prépondérant dans la régulation de l’angiogenèse physiologique et pathologique (Ferrara et Davis-Smyth, 1997). Son expression est importante à la fois pour l’induction de nouveaux vaisseaux et pour le maintien d’une vascularisation fonctionnelle dans différents organes (Eremina et coll., 2003; Lammert et

coll., 2003). Dans la glande surrénale, la vascularisation est maintenue par la régulation de

l’expression du VEGF en réponse à l’hormone hypophysaire ACTH (Keramidas et coll., 2004). Notre laboratoire a démontré que la stimulation de cellules corticosurrénaliennes bovines (BAC) en culture primaire par l’ACTH, induisait une augmentation rapide et transitoire du taux d’ARNm du VEGF, avec un pic d’expression autour de 3 h après la stimulation (Chinn et coll., 2002). Ce mécanisme est indépendant de la transcription. En effet, cette augmentation est également observée en présence de 5,6-Dichloro-ß-D ribofuranosyl benzimidazole (DRB), un puissant inhibiteur de la transcription. L’expression du VEGF est régulée à différents niveaux et notamment au niveau post-transcriptionnel par différentes protéines capables de se lier à la région 3’UTR de son ARNm et d’induire sa stabilisation, comme HuR (Levy NS et coll., 1998), ou sa déstabilisation, comme TIS11b, que notre équipe a identifiée récemment. L’expression de TIS11b est également induite par l’ACTH mais de façon concomitante avec la phase de déstabilisation de l’ARNm du VEGF. Le rôle de TIS11b sur la déstabilisation de l’ARNm du VEGF a tout d’abord été suggéré par son effet déstabilisateur de l’ARNm d’un gène rapporteur, le gène de la luciférase, cloné en amont de la région 3’UTR du VEGF (Luc-3’UTR) dans des cellules NIH-3T3 en culture. L’interaction entre TIS11b et la région 3’UTR de l’ARNm du VEGF dans des cellules vivantes a par la suite été démontrée par la technique de ChIP (chromatin immunoprecipitation) (Ciais

et coll., 2004). Par ailleurs, l’extinction de l’expression de TIS11b par des ARN interférents

dans des cellules BAC indique clairement que TIS11b participe au contrôle de l’expression du VEGF dans des conditions basales ainsi qu’en réponse à une stimulation par l’ACTH. Par la suite, il a également été démontré dans ce modèle, que l’ACTH induit une translocation de la protéine HuR, stabilisatrice des ARNm, du noyau vers le cytoplasme (Cherradi et coll., 2006). L’inhibition de cette translocation ou la suppression de HuR dans les cellules corticosurrénaliennes par interférence ARN bloque l’induction du taux d’ARNm du VEGF par l’ACTH. TIS11b et HuR ont des sites de liaison à l’ARNm du VEGF très proches. In vitro, les deux protéines se lient à la région 3’UTR du VEGF. Une surexpression de TIS11b inhibe l’induction de l’activité de la luciférase par la surexpression de HuR, via la région 3’UTR de

l’ARNm du VEGF. L’activité déstabilisatrice de TIS11b semble donc être prédominante sur l’activité stabilisatrice de HuR sur l’ARNm du VEGF, in vitro.

Dans les cellules corticosurrénaliennes, l’ACTH stimule l’adényl cyclase via son récepteur spécifique couplé aux protéines G (MC2R) et active la voie de l’AMPc et de la PKA. Il a été montré que la forskoline, un activateur de l’adényl cyclase, est aussi puissante que l’ACTH pour induire l’augmentation du taux d’ARNm du VEGF ainsi que l’expression de TIS11b (Gaillard et coll., 2000; Chinn et coll., 2002). Les trois protéines de la famille TIS11 sont phosphorylées en réponse à de nombreux stimuli et certains de ces sites de phosphorylation semblent être importants pour les interactions avec d’autres protéines. A ce jour, la phosphorylation des membres de la famille TIS11 est corrélée à une inhibition de leur activité déstabilisatrice (Johnson et coll., 2002; Schmidlin et coll., 2004). Notamment, il a été décrit pour TTP, le prototype de la famille TIS11, que la MAPK-activated kinase 2 (MK2) régule à la fois son activité et son expression dans les macrophages en réponse à une stimulation par des lipopolysaccharides (LPS) (Hitti et coll., 2006). MK2 induit l’expression de TTP de façon concomittante à celle des cytokines qu’elle va réguler par déstabilisation de leur ARNm. La phosphorylation de MK2 induit la phosphorylation de TTP et son accumulation sous forme inactive dans le cytoplasme. Les ARNm des cytokines cibles de TTP ne sont pas déstabilisés par TTP au cours de cette première phase d’induction de leur expression. Dans la deuxième phase, une importante quantité de TTP est prête à être activée dans le cytoplasme pour induire une déstabilisation des ARNm des cytokines inflammatoires, notamment du TNF-alpha, et moduler ainsi leur expression (Sun et coll., 2007). Pour l’instant, seules la protéine kinase B (PKB) et MK2 ont été décrites capables de phosphoryler la protéine TIS11b (Schmidlin et coll., 2004; Maitra et coll., 2008). Très récemment la PKA a été rapportée capable de phosphoryler TTP in vitro (Cao et Lin, 2008). L’activation de la PKA induit également l’expression de TIS11b dans un modèle de cellules humaines « osteoblastes-like » en réponse à l’hormone parathyroïdienne, mais la phosphorylation de TIS11b par cette kinase n’a pas été documentée dans cette étude (Reppe et coll., 2004). Dans ce contexte, nous avons souhaité évaluer si la PKA pouvait être impliquée dans la régulation de l’activité déstabilisatrice de TIS11b en réponse à l’ACTH. Dans un premier temps, nous avons examiné l’état de phosphorylation de TIS11b dans les cellules corticosurrénaliennes en culture stimulées par l’ACTH. Puis, nous avons évalué la phosphorylation de TIS11b par la PKA in vitro, et déterminé les sites potentiels de phosphorylation, au moyen de protéines mutées ponctuellement et de peptides synthétiques. Ces protéines TIS11b mutées ont ensuite été utilisées pour déterminer l’influence des phosphorylations par la PKA sur l’activité de TIS11b dans la déstabilisation des ARNm.

2. Résultats et discussion

2.1. Phosphorylation de TIS11b dans les cellules BAC en culture en