Effet des protéines de fusion Flag-R7 ou Flag-R9-TIS11b sur l’expression du VEGF

Afin d’évaluer l’activité des protéines de fusion sur l’expression du VEGF, in vivo, nous avons injecté soit la protéine de fusion Flag-TIS11b soit la protéine de fusion Flag-R7-TIS11b, à 100 nM, dans une surrénale de souris. 24 h après l’injection, la glande a été prélevée, fixée et incluse en paraffine. Des coupes de 7 µm ont été réalisées et marquées par immunohistochimie avec un anticorps anti-VEGF (figure 6A, p. 156).

Le choix de la concentration utilisée et du délai de prélèvement de la glande a été effectué en fonction des expériences précédentes d’incubation des protéines de fusion avec les

cellules en culture. L’injection de 100 nM de protéine de fusion Flag-R7-TIS11b a montré une diminution importante de l’expression du VEGF par rapport à une glande dans laquelle la protéine de fusion Flag-TIS11b a été injectée. De plus, cette diminution est homogène dans toute la glande, non seulement sur toute la surface de la coupe, mais également sur toutes les coupes observées, indiquant que la protéine de fusion Flag-R7-TIS11b diffuse de manière importante dans tout le tissu. De manière intéressante, l’injection de la protéine Flag-TIS11b montre une légère diminution d’expression du VEGF au niveau du point d’injection (données non montrées), confirmant qu’une faible quantité de protéine sans PTD est internalisée et biologiquement active, néanmoins, cet effet est très localisé, ne diffuse pas sur toute la surface de la coupe et est limité à quelques coupes de la glande.

Parallèlement à ce travail, nous avons également injecté 100 nM de protéine de fusion Flag- R9-TIS11b, versus du tampon seul, dans les surrénales de souris. Les glandes ont été prélevées soit 24 h soit 48 h après l’injection et leurs ARN ont été purifiés et analysés par RT-PCR avec des amorces amplifiant le VEGF rapporté à l’amplification du gène de ménage HPRT (figure 6B, p. 156). Nous avons pu observer par cette méthode que l’expression de l’ARNm du VEGF, était diminuée d’environ 50 % par l’injection de la protéine de fusion Flag- R9-TIS11b après 24 h. De plus, nous avons également pu observer que cette diminution était maintenue après 48 h.

En conclusion

fusion Flag-Tat-, Flag-R7- et Flag-R9-TIS11b sont capables d’induire une diminution du taux d’ARNm du VEGF ainsi que de la production de la protéine VEGF, dans des cellules en culture après 24 h d’incubation. De plus, nous avons montré que les PTD polyargines R7 et R9 fusionnés à TIS11b sont plus efficaces que le PTD Tat dans l’inhibition de l’expression du VEGF. En effet, les protéines Flag-R7- et Flag-R9-TIS11b ont montré une activité plus marquée que la protéine Flag-Tat-TIS11b, que ce soit pour la déstabilisation de l’ARNm de VEGF ou pour la production de la protéine VEGF, et ceci bien que la protéine Flag-Tat- TIS11b montre, dans les tests d’internalisation, un pourcentage de cellules marquées plus important que la protéine Flag-R9-TIS11b. Une des explications possibles de ce résultat pourrait impliquer la localisation intracellulaire induite par les PTD. En effet, le PTD Tat composé des acides aminés 47 à 57, est issu de la protéine Tat du virus HIV qui est un facteur de transcription dont la cible est nucléaire (Potocky et coll., 2003). Il a été rapporté qu’un signal de localisation nucléaire (NLS), qui contribue à la localisation de Tat dans le noyau des cellules infectées où elle exerce sa fonction transactivatrice, est présent entre les acides aminés 47 et 57 de la protéine (Ruben et coll., 1989). Le site majeur de dégradation

des ARNm étant le cytoplasme, ceci pourrait expliquer l’efficacité moindre de Flag-Tat- TIS11b par rapport à Flag-R7- et Flag-R9-TIS11b. Une localisation nucléaire de protéines fusionnées aux polyarginines a également été décrite. Néanmoins celle-ci semble induite par de fortes concentrations de protéines de fusion (Duchardt et coll., 2007).

Dans notre étude, il n’est pas possible de déterminer si la localisation subcellulaire de TIS11b fusionnée au PTD Tat est à l’origine de son défaut d’efficacité par rapport aux autres PTD. L’acquisition des images en microscopie à fluorescence ou confocale a été réalisée 2 h après le début de l’internalisation et l’activité sur la diminution de la production du VEGF a été mesurée 24 h après l’incubation. Les protéines de fusion n’ont donc probablement plus la même localisation subcellulaire. De plus, une acquisition d’image à 24 h ne permettrait pas de déterminer la localisation subcellulaire des protéines de fusion. La demi-vie courte de la protéine d’une part, réduirait le signal à un niveau inférieur au seuil de détection de la fluorescence, et d’autre part, engendrerait la détection de fluorochrome seul, ce qui pourrait induire en erreur quant à la localisation subcellulaire de la protéine de fusion marquée. Il a par ailleurs été décrit que la nature du fluorochrome pouvait influencer la voie d’internalisation ainsi que la localisation subcellulaire des protéines de fusion marquées (Morris et coll., 2008).

Les protéines Flag-R7- et Flag-R9-TIS11b ont induit une diminution de 50 % de la production de VEGF en 24 h. L’expression du VEGF est très finement régulée physiologiquement, et la délétion hétérozygote de son gène est létale (Carmeliet et coll., 1996; Ferrara et coll., 1996), indiquant une sensibilité importante de l’organisme au taux de VEGF, tout au moins au cours du développement embryonnaire (Dibbens et coll., 2001). Par ailleurs, l’expression de VEGF semble avoir également un rôle prépondérant dans la survie des cellules endothéliales (Lee S et coll., 2007). Le défaut de VEGF induit l’apoptose des cellules endothéliales ainsi qu’une régression de la vascularisation (Bergers et Benjamin, 2003; Lee S et coll., 2007). La diminution de 50 % du taux de VEGF serait donc suffisante pour inhiber l’angiogenèse et éventuellement pour induire une régression de la vascularisation, et ceci par deux voies : d’une part, par diminution de la stimulation paracrine du VEGF sur les cellules endothéliales, et d’autre part, par l’apoptose des cellules endothéliales induite par la diminution de leur stimulation intracrine par le VEGF.

Par ailleurs, nos résultats ont été obtenus avec une concentration de 100 nM de protéine de fusion, concentration compatible avec une utilisation thérapeutique in vivo, et la diminution d’expression du VEGF est observée jusqu’à 48 h après une seule injection dans la glande surrénale.

L’ensemble de ces données indique donc que les protéines de fusion Flag-R7- et Flag-R9- TIS11b sont de bons candidats pour réaliser des tests d’inhibition de croissance tumorale, in vivo, sur des tumeurs pré-établies.

2

ème

_{Partie :}

Effet de TIS11b sur la croissance

tumorale

1. Introduction

Les résultats décrits dans la 1ère partie, nous ont permis de démontrer que les protéines PTD-TIS11b sont internalisées dans les cellules, et sont efficaces dans la déstabilisation de l’ARNm du VEGF ainsi que dans l’inhibition de la production de la protéine VEGF par les cellules COS7 en culture. De plus, l’injection de ces protéines PTD-TIS11b purifiées dans un organe très vascularisé comme la glande surrénale, induit une diminution de la quantité de VEGF dans cet organe. Ces résultats encourageants nous ont incités à évaluer l’efficacité de TIS11b, in vivo, dans un modèle tumoral. Pour cela, deux stratégies ont été mises en place. La première a consisté à faire la preuve de concept de notre hypothèse d’utiliser TIS11b pour induire une diminution de la croissance tumorale, en établissant une lignée tumorale stable surexprimant TIS11b. La deuxième a consisté à injecter les protéines Flag-PTD- TIS11b directement dans des tumeurs pré-établies et à évaluer leur capacité à induire une régression de ces tumeurs.

Les tumeurs ont été générées à partir de la lignée cellulaire LL2 (Dus et coll., 1985). Cette lignée tumorale dérive des cellules LLC (Lewis Lung Carcinoma) murines (Bertram et Janik, 1980) qui ont subi des passages in vivo, chez des souris C57BL6 (Dus et coll., 1985). Notre choix s’est porté sur cette lignée cellulaire car, ces cellules, LL2 ou LLC, présentent l’avantage d’une part, de croître rapidement lorsqu’elles sont implantées chez des souris, et d’autre part, d’avoir une angiogenèse tumorale fortement dépendante du VEGF. Par ailleurs, elles présentent un taux d’expression basal de la protéine TIS11b très faible, limitant les interférences de la protéine endogène avec la protéine exogène.