Impact des AuNP sur la réponse inflammatoire des BMDC

En parallèle des phénomènes d’activation, la reconnaissance d’un PAMP par les CPA induit la synthèse de cytokines pro inflammatoires ou immuno-modulatrices.

Pour étudier l’impact d’une exposition aux AuNP sur cette réponse inflammatoire, Le milieu de culture des BMDC exposées ou non aux AuNP (24h) puis au LPS (2µg/mL, 24h additionnelles) a été prélevé. Les cytokines pro inflammatoires IL-6, TNF et les cytokines immuno-régulatrices MCP-1, IL-10, IL-12 et IL-23 ont été dosées par un test multiparamétrique CBA. La figure 13 montre la quantité relative de chacune de ces cytokines par rapport au contrôle DC en présence de LPS.

La partie gauche de la figure (« no LPS ») montre qu’une exposition aux AuNP n’induit pas la synthèse de cytokine et la réponse inflammatoire.

En revanche, lorsque les BMDC sont exposées aux AuNP (100µg/mL, 24h) puis incubées avec du LPS pendant 24h additionnelles (partie droite « LPS »), la synthèse d’IL-6 est altérée de 40%, et les productions d’IL-12 et IL-23 sont diminuées de 50%. La synthèse de MCP-1, IL-10 et TNF n’est pas altérée. Ces effets dépendent de la dose de AuNP utilisée puisque les sécrétions d’IL-6, IL-12 et IL-23 sont diminuées de façon moins importante avec 10µg/mL de AuNP.

Ainsi, une exposition aux AuNP diminue la réponse inflammatoire des DC lors d’une exposition subséquente au LPS. Or, Ces cytokines sont impliquées dans la polarisation de la réponse T helper (Th) ; ces modifications pourraient avoir un impact majeur sur le fonctionnement du système immunitaire.

Figure 13 : Impact des AuNP sur la synthèse de cytokines par les BMDC. Les BMDC ont été exposées aux AuNP (concentrations précisées, 24h) puis exposées ou non au LPS (2µg/mL, 24h) comme dans la figure 11. La production de cytokines a été évaluée dans le surnageant de culture par CBA, et standardisée sur le contrôle incubé avec LPS sans AuNP (« LPS No NP »). Un test de Student par paire a été réalisé pour comparer chaque résultat à ce contrôle. *= p-value<0.05, **= p-value < 0,01; ***= p-value < 0,001. Les résultats sont représentatifs de 3 expériences indépendantes. Les valeurs moyennes des quantifications de cytokines sont données dans ce tableau

IL-6 IL-10 IL-12 IL-23 TNF MCP-1 100% 11ng/mL 375pg/mL 395pg/mL 139pg/mL 5.9ng/mL 3.9ng/mL

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I. Impact des AuNP sur la polarisation de la réponse T par les BMDC.

En effet, comme précisé en introduction de ce travail, lorsque les CPA présentent un antigène aux LT naïfs dans les ganglions lymphatiques drainants, les cytokines présentes dans le microenvironnement des LT jouent un rôle essentiel dans leur devenir (Figure d’introduction 16). Entre autres, la cytokine IL-12 est impliquée dans l’initiation d’une réponse immunitaire adaptative de type Th1 (cytotoxique) et réprime la réponse Th2. Afin de vérifier l’impact potentiel d’une exposition aux AuNP sur l’activité de polarisation de la réponse T par les BMDC, nous avons réalisé un test présentation antigénique in vitro.

Brièvement, les BMDC, exposées aux AuNP puis activées avec LPS comme précédemment, sont incubées avec l’antigène modèle ovalbumine (OVA). Ces cellules sont mises en co-culture avec des lymphocytes T purifiés de la rate de souris transgéniques OT-II selon un ratio de 1DC pour 4T. Les souris OT-II présentent un récepteur T (TCR) transgénique spécifique d’OVA présentée par les CPA sur le MHC-II. Après 4 jours, le surnageant de ces co-cultures a été récupéré et les secrétions de cytokines spécifiques de la polarisation de la réponse T ont été quantifiées par test CBA :

 interféron gamma (IFN-γ), effecteur majeur de la réponse Th1

 IL-13 et IL-4, spécifiques de la réponse Th2

 IL-17, sécrétée lors de la réponse Th17.

La Figure 14 montre la quantité relative de chacune de ces cytokines par rapport au contrôle incubé avec OVA, sans NP (« OVA no NP »).

La partie gauche de la figure (« no OVA ») montre que les AuNP par elles-mêmes n’induisent pas de synthèse de cytokines par les LT.

En présence de l’antigène OVA (voir partie droite « OVA »), une exposition des BMDC aux AuNP (100µg/mL) induit une augmentation des synthèses d’IL-13 de près de 50% et la sécrétion d’IL-17 est accentuée de 130%, alors que la synthèse d’IFN-γ n’est pas altérée. La cytokine IL-4 n’est pas détectée.

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Cet effet dépend de la dose de AuNP à laquelle les BMDC ont été exposées utilisée puisque les sécrétions d’IL-13 et IL-17 sont augmentées de façon moins importante avec 10µg/mL de AuNP.

Ces données démontrent qu’une exposition aux AuNP peut perturber la balance Th1/Th2, en induisant une réponse humorale favorable au développement de Th2, et augmente la polarisation des LT vers une réponse Th17.

Figure 14 : Les AuNP modifient l’activité de polarisation de la réponse T par les BMDC. Les BMDC exposées aux AuNP (concentrations précisées dans la figure) sont activées ou non avec 2µg/mL de LPS et chargées avec 50µg/mL d’OVA pendant 8h. Ces cellules sont mises en co-culture avec des LT purifiés à partir de splénocytes de souris OT-II pendant 4 jours. La production de cytokines a été évaluée dans le surnageant de culture par CBA, et standardisée sur le contrôle incubé avec OVA sans AuNP (« OVA No NP »). Un test de Student par paire a été réalisé pour comparer chaque résultat à ce contrôle. *= p-value<0.05, **= p-value < 0,01. Les résultats sont représentatifs de 3 expériences indépendantes. Les valeurs moyennes des quantifications de cytokines sont données dans le tableau ci-dessous.

IL-13 IFN-γ IL-17 100% 752pg/mL 6.75ng/mL 789pg/mL

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