Développement d’un ensemble de tests in vitro pour évaluer l’immunotoxicité des NP à long terme

Au cours de cette étude, nous avons montré que les NP, de par leur capacité à s’accumuler dans les cellules du système immunitaire, posent une nouvelle problématique d’immunotoxicité fonctionnelle. Cet impact fonctionnel est indépendant de la cytotoxicité observée à forte concentration. Des études systématiques sont alors requises pour évaluer l’immunotoxicité de chaque nouvelle NP mise sur le marché. Ce point avait déjà été mis en évidence dans un rapport de la Food and Drug Administration (FDA) américaine. Ce rapport spécifiait que « si un composé […] s’accumule dans les cellules du système immunitaire, des études complémentaires d’immunotoxicologie devaient être envisagées ». Cependant, ce rapport ne fournissait que peu d’informations sur le type de test à mettre en place et pas de procédure propre aux nanomatériaux.

Or, les tests traditionnels ne sont parfois pas applicables aux nanomatériaux à cause de leurs propriétés optiques ou catalytiques. Ces matériaux peuvent interagir avec les réactifs et les méthodes de détection conventionnelles, donnant des résultats ininterprétables (Frohlich, 2015). Ces altérations retardent considérablement le développement d’une procédure standardisée. Nous avons rencontré ce problème lors de l’étude de l’endocytose du dextran fluorescent. Les AuNP interfèrent avec la fluorescence du FITC et ne permettent pas de conclure sur une potentielle altération de cette endocytose.

En 2009, Marina Dobrovolskaia et ses collègues publient une revue sur les adaptations qui peuvent être réalisées sur les tests in vitro et in vivo classiques pour contourner les interférences générées par les nanomatériaux (Dobrovolskaia, Germolec, & Weaver, 2009). En 2013, après plus de 10 ans d’efforts de standardisation, les organisations ATSM International et ISO établissent trois méthodes de test pour analyser les propriétés hémolytiques des NP, leurs effets sur le développement d’unités formant colonies de monocytes/macrophages, et leur contamination potentielle par des endotoxines. Si ces méthodes sont essentielles pour la validation de nouveaux nanomatériaux avant leur mise

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sur le marché, elles restent insuffisantes pour évaluer l’immunotoxicité des NP sur le large spectre des réponses immunitaires (Dobrovolskaia, Shurin, & Shvedova, 2016).

Dans cette étude, nous avons développé un ensemble de tests in vitro pour étudier l’impact d’une exposition aux NP sur les différentes étapes de la présentation antigénique.

Ces travaux ont permis de valider la biocompatibilité des Lipidots et des GdSI. Ces NP n’ont pas montré de toxicité aux différentes concentrations testées, aucun impact sur la phagocytose et sur l’activation des cellules. Ces NP n’induisent pas non plus de secrétions de cytokines par elles-mêmes et ne modifient pas l’activité de polarisation de la réponse T par les DC.

Pour les AuNP et les PLGA, la conclusion doit être un peu plus nuancée. Les AuNP s’accumulent dans les cellules sans toxicité. Elles n’altèrent pas la phagocytose et n’activent pas les DC. Cependant, elles modifient la sécrétion de cytokines et altèrent l’initiation de la réponse T lors de la rencontre subséquente avec un agent étranger. Les PLGA quant à elles sont toxiques à relativement base concentration. A dose sub-toxique, elles n’altèrent pas la phagocytose, mais activent une partie des cellules. Enfin, elles ne modifient pas l’activité de polarisation de la réponse T par les DC.

Cet ensemble de test permet de prédire l’immunotoxicité des NP à long terme. En effet, les macrophages et les cellules dendritiques perdurent dans les tissus de notre organisme pendant plusieurs années. Les modulations des fonctions des APC mises en évidence dans ces tests pourraient modifier la réponse de ces cellules à un pathogène plusieurs années après exposition aux particules.

Les technologies utilisées dans ces tests permettent de s’affranchir des interférences potentielles causées par les NP. Par exemple, nous avons mis au point un test de phagocytose indépendant de l’intensité de fluorescence qui donne plutôt un résultat entier, en nombre de sphères de polystyrène par cellule. Autre aspect novateur, cette étude ne se focalise pas sur l’impact direct d’une exposition aux NP sur les cellules du système immunitaire mais plutôt l’impact d’une telle exposition sur les mécanismes subséquents. Ainsi, dans notre modèle de présentation antigénique in vitro, nous analysons l’impact des NP sur ce mécanisme 24h après exposition.

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Ce travail de thèse s’inscrit aussi dans un contexte de restriction de l’expérimentation animale. En effet, depuis la dernière décennie, les règlementations françaises et européennes tendent à légiférer la part de l’expérimentation animale dans les recherches. L’ensemble de ces efforts de règlementation sont regroupés sous la dénomination « règle des 3R »

 Reduce : La législation impose de limiter le nombre d’animaux au strict minimum nécessaire à l’étude.

 Refine : le raffinage consiste à mettre en œuvre les moyens adéquats pour limiter la souffrance de l’animal

 Replace : Dans la mesure du possible, le législateur préconise de remplacer la part de l’in vivo par des études ex vivo ou in vitro.

Dans cette thèse, les animaux ne sont utilisés que pour extraire des DC primaires ou des LT, qui sont ensuite utilisés lors des tests in vitro. Cette démarche permet à la fois de réduire le nombre d’animaux sacrifiés pour l’étude (reduce) et d’éviter d’induire une réponse immunitaire in vivo qui peut être délétère et douloureuse pour l’animal (refine), en la remplaçant par un test de présentation plus rapide et plus reproductible ex vivo (replace). De plus, récemment, Marina Dobrovolskaia a publié une méthode pour transposer les résultats obtenus in vitro à l’animal entier in vivo. En autres, elle propose une relation entre la dose utilisée sur des cellules et la dose équivalente à laquelle serait exposé un corps humain (Dobrovolskaia & McNeil, 2013).

Cependant, si ces efforts de restriction de l’expérimentation animale sont éthiquement louables, les effets observés sur une culture cellulaire ne reflètent pas nécessairement l’impact d’une exposition aux NP sur un organisme entier. Ces problèmes de corrélation entre les résultats in vitro et in vivo ont été illustrés récemment par le travail de Lee et collaborateurs. Sur des macrophages murins in vitro, ils ont observé que les NP de silice mésoporeuse à forte porosité induisent moins d'expression de cytokines pro inflammatoires (TNFa, IL-1b et IL-6) que la silice colloïdale. En d'autres termes, la silice colloïdale est présentée comme particule immunogène avec moins de biocompatibilité (S. Lee, Yun, & Kim, 2011). Cependant, la même équipe a démontré qu’une injection intra-péritonéale de NP de silice mésoporeuse in vivo chez la souris induit une augmentation du volume de la

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rate, une variation des populations de lymphocytes dans cet organe et une augmentation des taux sériques d'IgG et d’IgM. A l’opposée, une injection de NP de silice colloïdale n’a aucun effet notable (S. Lee et al., 2013), ce qui est opposé aux résultats prédits à partir des études in vitro.

Ainsi, considérant nos résultats et les éléments de littérature évoqués ci-dessus, la perspective la plus importante de ce travail consisterait à valider in vivo les effets d’immunotoxicité observés in vitro. Cette analyse est particulièrement importante pour les AuNP. En effet, l’induction de la réponse Th17 mise en évidence dans nos tests pourrait engendrer in vivo des maladies de type auto-immunes. Il conviendrait d’observer si une injection d’AuNP peut modifier une réponse immunitaire subséquente chez la souris in vivo. La production de la cytokine IL-17 ou le recrutement de neutrophiles au niveau du site d’injection seraient des marqueurs pertinents pour montrer une polarisation des lymphocytes T vers le phénotype Th17.

B. Perspective 1 : vers la production de NP « safer by design »

La réactivité d’un nouveau composé avec le système immunitaire est un enjeu majeur pour l’industrie pharmaceutique. Cette problématique est particulièrement importante en nano-médecine. En effet, les intérêts potentiels des NP pour la médecine en tant que véhicule, vaccin, ou agent de théranostique ne peuvent être négligés. Cependant, ces promesses sont souvent remises en question du fait des risques de sécurité sanitaire que pourrait entraîner l’utilisation de ces nouveaux matériaux.

Les tests développés au cours de ces travaux de thèse permettent de mettre rapidement en évidence les propriétés immuno-toxicologiques de certaines NP (ici principalement les AuNP et PLGA). Ces données doivent alors être prises en compte pour développer des NP à visée thérapeutique plus compatibles, pour lesquelles les effets secondaires seront restreints. En effet, la dernière décennie de recherche a montré que le génie nanotechnologique peut modifier ces matériaux pour éviter ou cibler spécifiquement le système immunitaire (Dobrovolskaia et al., 2016). L’ensemble des efforts menés pour modifier la surface des NP

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afin de diminuer leurs effets secondaires est regroupé sous le terme d’approche « safer by design ».

Cette partie de la discussion expose l’ensemble des facteurs qui peuvent influencer la prise en charge des NP par le système immunitaire, et les récentes avancées dans la littérature sur ce sujet.

a. C’est la taille qui compte…

La taille des particules peut influer la biodistribution de ces dernières. En 2008, De jong a analysé la bio distribution in vivo d’AuNP de différentes tailles 10, 50, 100 et 250 nm, 24h après injection en intraveineuse dans la veine caudale de rat. Pour toutes les particules, la majorité des AuNP étaient localisées dans le foie et la rate, mais les NP de 10nm étaient présentes dans de nombreux organes, montrant une distribution taille dépendante (De Jong et al., 2008).

La taille peut aussi permettre de cibler un type cellulaire particulier. Les NP les plus petites (moins de 100nm) sont préférentiellement prises en charge par le DC, alors que les particules plus larges auront tendance à s’accumuler dans les macrophages (Fifis et al., 2004; Tsai et al., 2012). De nombreuses études ont rapporté que les NP de 50nm sont les plus adaptées pour cibler les DC, ce qui peut avoir un impact considérable dans les stratégies vaccinales.

Enfin, la taille influence le type d’immunité induite lors de l’interaction de la NP avec le système immunitaire. En 2007, une étude d’immunisation chez la souris a montré que des billes de polystyrène de 40nm complexées avec OVA induisent une réponse cellulaire de type Th1 ; alors que dans les mêmes conditions, une bille de 100nm induit plutôt une réponse de type Th2 (Mottram et al., 2007). Dans la même optique, il a été montré que les particules les plus petites induisent une plus forte réponse immunitaire que les particules submicroniques. Lors d’une instillation intra trachéale chez la souris, Les NP de Fe3O4 induisent une réponse inflammatoire au niveau des poumons, validée par une augmentation de la production de cytokines inflammatoires dans des cultures ex vivo de ganglions lymphatiques. Ces même NP inhibent la réponse subséquente à une administration intra trachéale de globules rouges de mouton. Fait intéressant, ce phénomène est exacerbé avec

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des NP de 35nm, en comparaison à des particules submicroniques de 147nm (Ban, Langonne, Huguet, & Goutet, 2012).

Ainsi, modifier la taille des NP à visée médicale dont les AuNP pourrait permettre de diminuer leurs effets secondaires.

b. Modification de surface et de charge des NP

Les propriétés de surface des NP peuvent influencer leur reconnaissance et leur prise en charge par le système immunitaire. Il est alors possible de modifier ces propriétés, en greffant par exemple des polymères sur la surface des NP. Le polymère le mieux caractérisé pour ces utilisations est le poly (éthylène glycol) (PEG), qui produit un environnement hydrophile autour de la particule la cachant du système immunitaire (Moghimi, 2002). Récemment, Mathaes et al ont montré que des NP de PLGA PEGylées sont moins internalisées par les macrophages que leurs équivalents nus (Mathaes, Winter, Besheer, & Engert, 2014). Cependant, des injections répétées de doses élevées de liposomes revêtus de PEG sont suivies par la formation d'anticorps spécifiques du PEG, Cela entraine une élimination accélérée des liposomes PEGylés (Ishida & Kiwada, 2008).

Dans le même esprit, Les NP de Fe2O3 revêtus de silice sont internalisées par les macrophages à un degré significativement plus élevé que les NP revêtues de dextran de taille comparable, par un processus actif dépendant du cytosquelette d'actine.

Ce « coating » de surface peut aussi modifier la toxicité de la particule. Par exemple, les NP de Fe2O3 revêtues de PEG ou de dextran ne sont pas toxiques pour les macrophages primaires dérivés de monocytes humains in vitro, cependant les mêmes NP revêtues de silice induisent une toxicité dose-dépendante pour des cellules dendritiques dérivées de monocytes (Kunzmann et al., 2011).

En plus de l'hydrophobicité, la charge superficielle joue un rôle important dans la détermination du devenir de la NP. Par rapport aux NP avec une charge neutre ou négative, les NP chargées positivement sont internalisées à un rythme plus rapide par les cellules. Thermodynamiquement, il est clair que la face extérieure de la membrane cellulaire possède une charge négative et l'absorption cellulaire de NP est entraînée par des caractéristiques électrostatiques (Najafi-Hajivar et al., 2016) . De plus, les NP chargées positivement sont généralement moins biocompatibles. Les NP à surface cationique, ou celles qui portent des

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ligands cationiques, interagissent électrostatiquement avec les membranes biologiques (Kurtz-Chalot et al., 2017). Ceci peut conduire à des lésions cellulaires, à l’induction de l’hémolyse, à l'activation et l’agrégation des plaquettes, et à l'induction de l'activité pro coagulante des leucocytes ; Des phénomènes de coagulation intravasculaire peuvent alors apparaitre (Greish et al., 2012).

c. Impact de la corona protéique sur la reconnaissance des NP

L'adsorption de protéines à la surface des NP après leur exposition aux fluides biologiques (plasma, sérum et autres fluides corporels) conduit à la formation de complexes protéine-NP appelés corona protéique. La formation de cette corona protéique dépend de la composition, de la taille, de la chimie de surface et de la forme des NP. Elle modifie le diamètre hydrodynamique de la particule et sa charge (Dobrovolskaia, Patri, et al., 2009). Cette corona a pour résultat l'altération du comportement biologique de la NP. Elle influence la façon dont les cellules et les tissus interagissent avec la NP et sa distribution dans l’organisme. Elle peut par exemple augmenter la biodisponibilité, entrainer la reconnaissance des particules par les récepteurs cellulaires, faciliter l'absorption cellulaire, activer des voies de signalisation et déclencher des réponses immunitaires (Najafi-Hajivar et al., 2016).

Par exemple, La corona peut modifier les propriétés immunotoxicologiques des nanotubes de carbone (CNT). Dutta et al ont montré que les CNT coatés avec de l’albumine empêchent l’activation de la cyclooxygenase-2 (Cox-2) par le LPS sur la lignée de macrophages RAW264.7, alors que les mêmes CNT couplées avec un surfactant ne peuvent pas se complexer à l’albumine et ne montrent pas cet effet anti-inflammatoire (Dutta et al., 2007). Dans la continuité, Pondman décrit que les CNT peuvent activer le complément. L'opsonisation du complément sur les CNT améliore significativement leur absorption par les cellules U937 et les monocytes humains (Pondman et al., 2014). Des analyses de qPCR en temps réel et de dosage multiplex montrent une régulation négative de TNF-α et IL-1β et une régulation positive d’IL-12 induite par les CNT-complément (Pondman et al., 2016). Dans un autre modèle de NP, Ruge et al ont révélé que des NP de magnétite recouvertes de protéine A du surfactant alvéolaire interagissent mieux que leurs contreparties nues avec une lignée de macrophages alvéolaires in vitro. Cela se traduit par une internalisation et une

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élimination accrues (Ruge et al., 2011). L’ensemble de ces résultats suggèrent que la reconnaissance des NP par les macrophages et leur devenir dépendent largement des constituants de la corona protéique qui se forme à leur surface.

De façon intéressante, il a été montré que l’adsorption des protéines (et en particulier du complément) à la surface de AuNP PEGylées est dépendante de la densité de PEG sur la particule. La formation de la corona est diminuée quand la densité de PEG augmente (Walkey et al., 2014). Cela permet d’envisager de maitriser la formation de la corona grâce à des modifications de surface sur les NP.

d. Modification de la forme

La forme des NP influence directement leur absorption par les cellules. L'utilisation de particules de polystyrène de tailles et de formes différentes a démontré que la forme joue un rôle remarquable dans l'initiation de la phagocytose. Les particules en forme de tige supérieures à 100 nm sont internalisées préférentiellement, suivies par les sphères, les cylindres et les cubes (Najafi-Hajivar et al., 2016).

En utilisant des filomicelles (assemblages de micelles de polymères très stables), Geng et al ont comparé le transport et l’internalisation de longs filaments souples avec des sphères de composition identique. Chez les rongeurs, les filomicelles persistent dans la circulation jusqu'à une semaine après l'injection intraveineuse, soit environ dix fois plus long que leurs homologues sphériques (Geng et al., 2007). Dans le même esprit, Mathaes et ses collègues ont analysé l’importance de la forme des NP de PLGA sur l’internalisation par les macrophages J774. Ils concluent que les PLGA allongées de 2µm sont moins internalisées que les NP sphériques de 150nm (Mathaes et al., 2014).

Ainsi, en modifiant la forme des NP, il est possible de modifier leur devenir dans l’organisme et de retarder ou accélérer sa prise en charge par le système immunitaire en fonction de l’objectif (thérapeutique, diagnostic, vaccinal) de la NP.

e. Impact du mode d’administration sur la réponse immunitaire

Les NP à visée médicale pourront être administrées de différentes manières soit par voie intradermique, orale, intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire ou par inhalation. Ces

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voies peuvent aboutir à diverses réponses immunitaires en raison de la présence de différentes sous-classes de cellules immunitaires dans chacune d’elles.

En évaluant quatre voies d'administration sur des particules lipidiques et polymères, Mohanan et al ont montré que les titres d’immunoglobulines G2a ainsi que les réponses immunitaires Th1 sont en étroite corrélation avec le type d'administration (Mohanan et al., 2010).

En général, l'administration intraveineuse de NP est associée à une réponse immunitaire plus forte. Cela peut être dû à l'exposition des NP à un environnement complexe de cellules sanguines et de protéines immédiatement après l'injection formant rapidement une corona protéique.

La peau est un site immunologiquement actif qui peut déclencher une réponse inflammatoire par l'intermédiaire de cellules immunitaires, telles que les cellules de Langerhans épidermiques et les DC dermiques.

Enfin, l'interaction avec les macrophages résidents ou alvéolaires en administration orale ou intra-nasale joue un rôle important dans la manipulation de matériaux étrangers dans cette voie (Najafi-Hajivar et al., 2016).

f. Perspective

Ainsi, de nombreux paramètres peuvent modifier le comportement des NP vis-à-vis des cellules du système immunitaire. Dans les mois suivant cette thèse, il adviendrait de modifier certaines propriétés de taille, de surface, de charge et de corona sur les AuNP, pour étudier l’impact de ces paramètres sur les fonctions immunitaires décrites dans l’étude. Cela donnerait également des pistes pour la production de AuNP plus sures.