Immobilisation de la protéine A

L’immobilisation de l’anticorps de capture par bio-affinité présente l’avantage d’espacer les anticorps de la surface et de contrôler leur orientation sur le support. L’anticorps de capture sélectionné (anti-SEATT) est produit chez le lapin, la protéine A (PrA) qui reconnait le fragment constant de cette famille d’IgG est bien adaptée (paragraphe 1.5.2. du chapitre 1).

Les surfaces précédemment sélectionnées (planes et nanostructurées) sont terminées par des fonctions amines. Ces fonctions sont dérivées en utilisant le 1,4-phenylene diisothiocyanate (PDITC). Ce « cross-linker » homobifonctionnel possède deux groupes isothiocyanate pouvant réagir avec les fonctions NH2 de la protéine et de la surface comme illustré sur la Figure 70. De plus, son noyau aromatique lui confère une rigidité qui permet d’éviter les pontages et

d’augmenter la quantité de groupements isothiocyanates disponibles pour greffer la protéine A via ses résidus amines.

Figure 70: Mécanisme d’immobilisation de la protéine A sur des surfaces amine activées par PDITC.

L’immobilisation de la protéine A sur les surfaces planes et nanostructurées a été suivie par QCM, le protocole expérimental est détaillé chapitre 2. Dans le Tableau 11 sont regroupées les variations de fréquence (/F) ainsi que les augmentations de masse ( m) et le taux de recouvrement (Γ) obtenus par application de l’équation de Sauerbrey.

Tableau 11 : Résultats QCM après injection de la protéine A sur les différentes surfaces testées. 20 mg/L Protéine A Surfaces - F5 (Hz) D5 (10^-6) m (ng/cm2) Γ (pmol/cm2)* Si-PEG 0 0 0 0 Au-PEG 0 0 0 0 Si-PEG-GNPs-PEG 0,6 0.1 11 0.2 Au-PEG-GNPs-PEG 1,7 0,3 30 0.7 Au-PEG-GNPs-CEA 1 0,2 18 0,4 Si-NH2/SH-GNPs 1 0,1 18 0,4 Au-NH2** 6,9 ± 2,7 (n=16) 1,5 122 ± 47 2,7 ± 1 Si-NH2 7,0 ± 1,3 (n=2) 0,3 ± 0,1 124 ± 23 2,7 ± 0,5 Au-NH2/SH-GNPs-CEA 7,0 ± 1,2 (n=17) 0,5 ± 0,1 124 ± 21 2,7 ± 0,5 Si-NH2/SH-GNPs-CEA 9,4 ± 2,2 (n=8) 0,9 ± 0,2 166 ± 39 3,7 ± 0,8

*avec MM=44,6 KDa pour la Protéine A, **²²

En un premier temps, comme pour la partie précédente, les surfaces ayant les densités et dispersions optimales en GNPs ont été envisagées, à savoir Si-PEG-GNPs-PEG et Au-PEG-GNPs-PEG. Malgré l’utilisation du PDITC, très peu de molécules de protéine A se sont greffées sur la surface comme en témoignent les faibles variations de fréquence enregistrées, 0,6 et 1,7 Hz pour le silicium et l’or, respectivement. Ces faibles quantités sont fort probablement le résultat des propriétés répulsives des PEG pour les protéines, hypothèse que corrobore l’absence totale d’adsorption de la protéine A sur les surfaces planes Au et Si terminées par des PEG. Cet effet serait dû à une forte interaction entre les molécules d’eau piégées dans la couche

de PEG qui entraine un gonflement de la longue chaine carbonée et la création d’une sphère de solvatation inaccessible aux protéines ²³. Nous avons donc opté, en un second temps, pour les surfaces nanostructurées pour lesquelles la post-fonctionnalisation a été réalisée avec la CEA et non le PEG en espérant que la présence de PEG dans la couche d’accroche ne limite pas le greffage de la protéine A. Mais dans ce cas également, le greffage des protéines A n’a pas été possible (voir Tableau 11), montrant que même lorsqu’ils sont utilisés pour la couche d’accroche des GNPs, les PEG continuent d’exercer un effet répulsif important vis-à-vis des protéines. Nous sommes donc arrivés à la conclusion que ces surfaces ne sont pas adaptées pour la construction d’immunocapteurs directs.

D’autre part, la faible variation de fréquence pour la surface Si-NH2/SH-GNPs prouve la nécessité de post-fonctionnaliser les GNPs afin d’accrocher la PrA.

Notre choix s’est donc porté sur les surfaces nanostructurées construites sans PEG pour lesquelles la densité et la dispersion des nanoparticules étaient optimales, à savoir celles déposées sur les SAMs NH2/SH (APTES-MUA pour le silicium et CEA-MUA pour l’or, voir diagramme bilan de la partie 3 du chapitre 3) avec une post-fonctionnalisation CEA (Figure 71-b). En se basant sur ce diagramme et afin d’avoir un juste équilibre entre la dispersion et la densité des GNPs, le dépôt des GNPs a été effectuée sous flux pour les surfaces de silicium et sous agitation pour les surfaces d’or. Ces surfaces ont été comparées à des surfaces planes équivalentes terminées par des fonctions amines (APTES pour le Si et CEA pour l’or (Figure 71-a)).

En comparant les valeurs obtenues pour les surfaces planes à celles des surfaces nanostructurées, on constate de faibles différences dans la quantité de PrA greffée pour les surfaces d’or alors que pour le silicium on obtient une augmentation de 1,4 fois par rapport à la quantité obtenue sur les deux immunocapteurs classiques (plan). Cette singularité pour le silicium est probablement due à la différence de dispersion de GNPs avec les surfaces d’or (voir diagramme bilan partie 3 du chapitre 3). Les faibles variations observées lors de l’adsorption de PrA sur les différents substrats peuvent résulter du fait que l’augmentation de la surface spécifique localisée autour des nanoparticules ne permet pas aux protéines A, de taille nanométrique, d’en bénéficier. Les recouvrements équivalents obtenus suggèrent que la quantité maximale adsorbée est davantage dépendante de la protéine et des répulsions entre protéines que de la nature de la sous-couche.

Les résultats obtenus pour les surfaces planes sont quasiment les mêmes montrant une reproductibilité des mesures dans le temps et une efficacité de l’étape d’activation quelle que soit la nature du substrat et la molécule réactive en surface.

2.3. Immobilisation de l’anticorps anti-SEA

L’anticorps de capture anti-SEATT a été immobilisé par bioaffinité sur la PrA dans un tampon PBS (protocole expérimental détaillé au chapitre 2). Cette étape a également été suivie par QCM. Le Tableau 12 regroupe les variations de fréquence résultant de l’immobilisation de l’anticorps anti-SEA sur les surfaces planes et nanostructurées. Pour les masses calculées m, il faut garder à l'esprit que l'eau hydrodynamiquement piégée dans le film n'est pas prise en compte dans ce calcul. Ceci peut expliquer pourquoi la densité d'anticorps calculée est le double d’une monocouche saturée d’anticorps (370 ng/cm²). Au vu des valeurs comparables de dissipation, ceci n'empêche pas la validité de la comparaison relative des données QCM obtenues pour l'adsorption d’anticorps sur les différentes surfaces.

Tableau 12 : Résultats QCM après injection de l’anti-SEA.

10 mg/L anti-SEATT Surfaces - F5 (Hz) ^D5 (10^-6) ^{m (ng/cm} 2) Γ (pmol/cm2)* !"#$ %&! '(! Au-NH2** 33,0 ± 6,0 1,0 ± 0,2 584 ± 106 3,9 ± 0,7 1,45 Si-NH2 33,7 ± 1,0 1,4 ± 0,3 596 ± 18 4,0 ± 0,1 1,5 Au-NH2/SH-GNPs-CEA 33,9 ± 5,9 1,3 ± 0,1 600 ± 104 4,0 ± 0,7 1,5 Si-NH2/SH-GNPs-CEA 32,6 ± 1,8 1,3 ± 0,1 577 ± 32 3,8 ± 0,2 1,0

Le Tableau 12 ne montre aucune différence significative dans les quantités d’anticorps de capture immobilisés sur les surfaces nanostructurées en comparaison des surfaces planes. Les surfaces de silicium nanostructurées pour lesquelles la quantité de protéine A fixée est plus grande donnent également le même recouvrement en anticorps. Ceci se traduit par un rapport anti-SEA/PrA constant dans le cas de des surfaces d’or et légèrement en baisse pour le silicium nanostructuré. Ce faible rapport observé pour les surfaces de silicium nanostructurées, est probablement dû à un encombrement stérique qui limiterait l’accessibilité des sites de reconnaissance des PrA adsorbées aux anticorps.

A ce stade, la densité de récepteurs est quasiment la même pour l’ensemble des substrats étudiés (plans et nanostructurés). Cette donnée va permettre une comparaison quantitative des réponses des biocapteurs dans ce qui suit et une estimation fiable de l’apport de la topologie pseudo-tridimensionnelle induite par les nanoparticules d’or.