Elaboration des surfaces nanostructurées 1. Réactifs utilisés

Les surfaces de silicium utilisées sont des plaquettes de silicium de <100> appelées wafers de silicium, commercialisées par Sigma Aldrich. Les deux faces des plaques ne sont pas identiques ; une face est polie, l’autre ne l’est pas. C’est la face polie qui est traitée par la suite. Ces plaquettes sont découpées en pièces de 1x1 cm². La désignation <100> se réfère à l’orientation des plans du silicium cristallin qui est décrite en utilisant les indices de Miller.

Les substrats d’or utilisés dans cette étude proviennent de la firme Arrandee^®. Ce sont des lamelles de verre borosilicaté sur lesquelles est évaporée une couche de 200 à 300 nm d'or.

Entre le verre et l'or, une couche de chrome de 50 Å est déposée pour assurer l'adhérence. Ces substrats ont des dimensions de 1x1 cm².

Le Tableau 3 énumère les différents réactifs chimiques utilisés lors de la préparation des surfaces nanostructurées de silicium et d’or. Tous les solvants utilisés sont de haut grade de pureté.

Tableau 3 : Liste de produits utilisés pour la fonctionnalisation des surfaces de silicium et d’or et la post-fonctionnalisation des GNPs.

Réactif Formule Masse

molaire (g.mol-1)

Pureté Fournisseur

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Tous les protocoles impliquant une agitation des surfaces immergées dans les solutions ont été faits avec une table d’agitation (va-et-vient).

2.2.2. Pré-fonctionnalisation des surfaces

2.2.2.1. Les surfaces d’or

i. Prétraitement des surfaces

Des mesures AFM sur les lamelles Arrandee^® montrent des îlots d'environ 30 nm à 60 nm de diamètre, répartis sur toute la surface. Ils ne présentent aucune structure particulière. Il est difficile d'étudier une telle surface, les variations de rugosité étant trop importantes. De plus, la surface ne possède pas de plans pour permettre le dépôt de thiols sur une large surface. Il nous faut donc traiter les échantillons Arrandee^®, en vue de pouvoir y déposer les SAMs.

En fait c‘est la surface (111) de l’or qui nous intéresse. Cette surface étant celle de moindre énergie, c'est suivant cette direction que le cristal a tendance à croitre. Une méthode pour obtenir des plans (111) à partir des échantillons Arrandee^®, consiste à recuire la surface. Pour ce faire, on utilise une flamme bleue butane/propane. Sa température de combustion permettant de recuire la surface sans sublimer l'or et ainsi sans détruire l'échantillon.

On effectue le recuit de la surface de préférence dans une pièce sombre pour pouvoir observer le rougissement de la surface. En appliquant la flamme sur la surface, il faut veiller à ne pas trop chauffer les bords, sinon le verre lui aussi chauffe et l'échantillon a tendance à se bomber. Lorsque la surface est légèrement rougie on ôte la surface de la flamme. Après quelques secondes, on recommence, et ceci environ dix fois. Cette technique permet d'obtenir de larges plans (111) d'or. Les surfaces d’or sont ensuite traitées dans un ozonateur (Bioforce Nanosciences) pendant 20 minutes, lavées à l’éthanol 1 fois pendant 15 min puis séchées par un flux de N2. Avant utilisation, les surfaces sont de nouveau ozonées.

ii. Fonctionnalisation des surfaces

Au-NH2

Les surfaces d’or sont immergées dans 20mL d’une solution de cystéamine (CEA) à 10 mM dans l’éthanol absolu. Après 24h d’immersion à température ambiante, les échantillons sont rincés 3 fois pendant 5 min dans un volume d’éthanol absolu équivalent au volume d’immersion. Le séchage des surfaces se fait sous flux d’azote.

Au-NH2/SH

Une solution de MUA à 10 mM et activée par EDC 1.2 eq. et NHS 2.4 eq dans l’éthanol pendant 1 h 30 – 2h. Les substrats Au-NH2 sont ensuite immergés dans cette solution. Après 24h, les échantillons sont rincés 3 fois 5 min dans un volume d’éthanol absolu équivalent au volume d’immersion puis séchées sous flux de N2.

Au-PEG

Les surfaces d’or sont immergées dans 20mL d’une solution d’acide 11-mercaptoundecanoique (10 mM) dans l’éthanol à température ambiante pendant 18 h puis rincées 3 fois pendant 5 min dans un volume d’éthanol équivalent au volume d’immersion. Le séchage des surfaces se fait sous flux d’azote.

Une goutte (150 ,L) d’une solution d’EDC (12 mM)/ NHS (24 mM) dans l’eau ultra-pure est déposée sur les surfaces d’or fonctionnalisées pendant 2 h après quoi les surfaces sont rincées à l’eau ultra-pure et séchées sous flux d’azote.

A l’aide d’une micropipette, une goutte de 600 ,L de Poly(ethylene glycol) bisamine (DAPEG)45 préalablement chauffé à 98°C est déposée sur la surface. Une seconde plaque issue

du même protocole est placée par-dessus de façon à former un sandwich. Les sandwichs formés sont placés dans une étuve à 98°C pendant une nuit. Les surfaces sont séparées sous sonication dans l’eau pendant 15 min, rincées et séchées sous flux d’azote.

2.2.2.2. Les surfaces de silicium

i. Prétraitement des surfaces

L’oxydation de la surface est une condition sine qua non à la fonctionnalisation des surfaces de silicium (voir paragraphe 1.1. du chapitre 3). Afin d’obtenir une forte densité de groupements hydroxyles (OH) en surface, la procédure de nettoyage suivante a été utilisée ¹⁰ :

- Phase d’élimination des contaminants minéraux de type "poussières": les surfaces sont immergées dans une solution d’Hellmanex^® à 2% (v/v) pendant 2h sous ultrasons puis rincées 5 fois dans l’eau puis séchées sous flux d’azote.

- Phase d’élimination des contaminants organiques : les surfaces sont ensuite immergées dans un mélange d’acide chlorhydrique 37% et de méthanol (v/v = 1/1) pendant 1h sous agitation puis rincées 5 fois à l’eau.

Les fonctions réactives -OH sont créées en immergeant les surfaces dans une solution d’acide sulfurique concentré pendant une heure après quoi les surfaces sont rincées à l’eau ultra-pure puis séchées sous un flux d’azote. Ces surfaces sont directement utilisées pour l’étape de silanisation sinon stockées dans de l’eau ultra-pure.

ii. Fonctionnalisation des surfaces

Si-NH2

Les surfaces de silicium nettoyées sont immergées dans 50 mL d’une solution d’APTES 50 mM dans du toluène anhydre et portés à 75°C pendant 24 h. Après l'étape de silanisation, les échantillons ont été soumis aux ultrasons pendant 10 min dans du toluène anhydre, séchés sous flux d’azote puis mis à l’étuve à 90°C pendant 2 h ¹¹.

Si-NH2/SH

Une solution de MUA à une concentration de 10 mM a été mélangée à volumes égaux à une solution de Nhydroxysuccinimide (NHS) à 24 mM et de N(3dimethylaminopropyl)N -ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) à 12 mM. Ces solutions ont été préparées dans l’éthanol. Après 90 min, les surfaces de silicium greffée amine, sont immergées pendant 90 minutes sous agitation dans la solution de MUA, de NHS et de EDC. Enfin les surfaces sont rincées dans un bain d’éthanol pendant 5 min puis séchées sous flux d’azote.

Si-PEG

A l’aide d’une micropipette, une goutte (150 ,L) de GOPTS est déposée à la surface d’une plaque de silicium sur laquelle une seconde plaque est placée de façon à former un sandwich. Les sandwichs sont conservés à température ambiante pendant 3 h après quoi les deux plaques sont séparées et plongées 5 min dans de l’éthanol puis 5 min dans du méthanol et une nouvelle fois 5 min dans de l’éthanol (sous sonication à chaque fois). Les plaques sont enfin séchées sous un flux d’azote et chauffées à 85°C pendant 5 min.

Une goutte de 600 ,L de DAPEG45 préalablement chauffé à 98°C est déposée sur une plaque de silicium fonctionnalisée GOPTS. Une seconde plaque est placée par-dessus de façon à former un sandwich que l’on incube à 98°C pendant 12 h. Les surfaces sont par la suite séparées à l’aide d’une pince, plongées dans de l’eau ultra-pure sous sonication pendant 15 min, rincées 3 fois 5 min à l’eau ultra-pure puis séchées sous un flux d’azote ¹².

2.2.3. Dépôt des GNPs

Les GNPs synthétisées par la voie citrate/acide tannique ont été ensuite déposées sur les surfaces fonctionnalisées. Chaque plaque est immergée dans 5mL de solution non diluée de GNPs pendant 2 h sous agitation (utilisation d’une table d’agitation) ou sous sonication. Les surfaces sont ensuite rincées 2 x 5 min à l’eau ultra-pure et séchées sous flux de N2.

Les GNPs ont été aussi déposées sous flux avec suivi en temps réel par QCM-D. Les quartz fonctionnalisés avec la même procédure décrite précédemment ont été montés dans la QCM. L'ordre d'injections a été effectué comme suit à un débit de 50 µL/min :

(1) Stabilisation dans l’eau ultra-pure pendant 10-20 min ;

(2) injection de la solution de GNPs 10 fois diluée à l’eau pendant 50 min ; (3) lavage à l’eau.

2.2.4. Post-fonctionnalisation des GNPs

Les plaques d’or et de silicium nanostructurées sont immergées dans une solution de CEA ou DAPEG68 à une concentration de 1 mM dans l’éthanol pendant 2 h. Elles sont ensuite rincées 2 fois pendant 5 min à l’éthanol puis séchées sous flux d’azote.

2.3. Construction et tests des immunocapteurs