Dans cette partie sont présentés les résultats obtenus lors de la construction, sur des surfaces planes et nanostructurées, d’immunocapteurs opérant au format indirect pour détecter le diclofénac ainsi que les données obtenues par QCM-D pour le suivi de la reconnaissance anticorps/diclofénac et de la spécificité de l’interaction. Elle se termine par l’étude de la régénération des immunocapteurs et de la stabilité de la couche de nanoparticules au cours de ce cycle.
1.1. Principe de détection
L’immunodétection de molécules de faible poids moléculaire telles que le diclofénac est sujette à de multiples défis. Le premier concerne la production d’anticorps spécifiques. En effet, les anticorps d’haptènes sont moins affins que les anticorps des cibles protéiques et présentent souvent des réactivités croisées vis-à-vis de molécules de structures voisines. Cette partie du travail ayant été conduite dans le cadre d’une ANR franco-allemande, (NArBioS, Nanoscaled architectures for sensitive biosensing of small molecules) nous avons pu bénéficier des anticorps polyclonaux (anti-DCF) spécifiques et affins produits et testés par nos collaborateurs
8c. Ces anticorps ont été utilisés pour l'analyse de ce composé dans l'eau de surface et des eaux usées en Allemagne et en Autriche et montrent une haute sensibilité en ELISA (6 ng/L pour l’eau du robinet et 60 ng/L pour eaux usées) 8c. De plus, pour une détection dans les eaux usées, la préparation d’échantillons est minimale ; seules la filtration et la dilution sont requises 4a. Le second défi concerne la sensibilité des techniques de transduction. En effet, le signal de la plupart de ces techniques est souvent lié au poids moléculaire de la cible. Il est donc difficile, sans amplification, d’être dans une gamme raisonnable de sensibilité. Enfin, le format indirect adapté à ce type de cible, est basé sur une détection par compétition, il nécessite donc une excellente accessibilité de la cible et une reproductibilité parfaite. Ainsi, l'immobilisation contrôlée d’un ligand de structure analogue de celle de l’analyte sur les surfaces nanostructurées est une étape clé dans le développement du biocapteur indirect, et sera optimisée en premier dans ce qui suit. Au vu des résultats du chapitre précédent, les surfaces d’or et de silicium
nanostructurées fonctionnalisées et post-fonctionnalisées PEG présentent la densité et la dispersion de GNPs optimales. A ce titre, elles seront sélectionnées pour développer l’immunocapteur piézoélectrique nanostructuré pour le diclofénac et pour le suivi en QCM-D de la reconnaissance anticorps anti-DCF/ DCF. L’apport de la nanostructuration sera estimé en comparant avec des surfaces planes (sans GNPs) équivalentes : Si-PEG pour le silicium et Au-PEG pour l’or comme schématisé sur la Figure 62. Enfin, la régénération de l’immunocapteur sera explorée ainsi que la stabilité de la couche de nanoparticules pendant ce cycle.
Figure 62 : Schéma récapitulatif de la construction de l’immunocapteur du diclofénac (DCF) sur des surfaces planes (a) et nanostructurées (b).
1.2. Greffage et caractérisation du diclofénac
§Le diclofénac est immobilisé de manière covalente ce qui permet en premier lieu d’éviter sa désorption lorsqu’il est impliqué dans une reconnaissance moléculaire avec l’anticorps et en second lieu la régénération du biocapteur par rupture de l’interaction Ab/Ag et décrochage de l'anticorps.
Ces travaux ont donné lieu à une publication commune avec les partenaires allemands sur les surfaces planes, jointe au manuscrit 18. Huebner, M.; Ben Haddada, M.; Methivier, C.; Niessner, R.; Knopp, D.; Boujday, S., Layer-by-layer generation of PEG-based regenerable immunosensing surfaces for small-sized analytes. Biosens. Bioelectron. 2015, 67, 334-341.
Le greffage du diclofénac sur les films de nanoparticules d’or post-fonctionnalisées fait intervenir sa fonction acide carboxylique (activé en solution) qui réagit avec les fonctions amines terminales du PEG en formant une fonction amide 18 (voir Figure 63). Le protocole expérimental auquel nous avons eu recours est détaillé dans le chapitre 2.
Figure 63 : Greffage du diclofénac sur les surfaces planes et nanostructurées.
Après greffage du DCF, les substrats plans ont été caractérisés par PM-IRRAS, GA-ATR, XPS et mesure de l’angle de contact. La taille de la molécule de diclofénac ainsi que les faibles quantités utilisées n’ont pas permis d’observer des bandes caractéristiques attestant le greffage de cette molécule sur les surfaces PEG-ylées. Les mesures d’angle de contact donnent également une valeur comparable avant et après greffage du DCF (43 et 45°). Le recours aux analyses par XPS a été nécessaire pour vérifier le greffage du diclofénac grâce à la présence du chlore sur les surfaces. L’intégration des données a permis d’estimer la quantité de chlore présent à 0,2% en pourcentage massique (Tableau 9). Le pic de l’azote (N1s) confirme également le greffage du diclofénac. Si la réaction du greffage était totale, on obtiendrait 3 atomes d’azote (2 du DAPEG et 1 du DCF) pour 2 atomes de chlore, ce qui correspond à un rapport Cl/N de 0,67. Le rapport obtenu de 0,25 indique que seule une fraction des fonctions amines du DAPEG a réagi avec le DCF. On observe aussi une diminution de l’intensité de la contribution des NH3+ des amines terminales à 403 eV et augmentation de la contribution à 401 eV correspondant à la fonction NH ou NH2 du fait de la formation des liaisons amides entre le diclofénac et les fonctions amines du PEG en surface.
Tableau 9 : Composition atomique des surfaces de Si planes avant et après immobilisation du diclofénac 18.
ENERGIE DE