Imagerie Calcique

Nous avons utilisé la technique d’imagerie calcique in vivo afin d’observer au niveau du cerveau, les variations de la [Ca2+]i après l’ajout de caféine ou de solution saline dans l’hémolymphe. Nous avons utilisé la procédure décrite par Hourcade et al. (2009) avec quelques modifications.

a. Préparation des abeilles

Les abeilles sont endormies et placées sur un support d’imagerie en plexiglas permettant d’isoler la région céphalique du reste du corps de l’abeille (figure 26A). Une goutte de cire fondue est appliquée sur le proboscis et sur les mandibules afin de

maintenir l’abeille dans l’axe du portoir et d’éviter d’éventuels mouvements pouvant perturber les enregistrements optophysiologiques. De la cire est ensuite déposée autour de la partie supérieure de la capsule céphalique où aura lieu la dissection. Les antennes sont bloquées vers l’avant grâce à des épines de cactus plantées dans la cire. Puis, une lamelle de plastique transparente est déposée sur les épines de cactus et fixée avec de la cire. Enfin, de la colle (Araldite, Coubert) est déposée autour de la capsule céphalique afin de rendre la région céphalique étanche (figure 26B). Après séchage de la colle (environ 30 minutes), une fenêtre rectangulaire est découpée à l’aide d’un microscalpel dans la cuticule céphalique entre la base des antennes et l’ocelle médian, et entre les yeux composés. Les glandes mandibulaires, le neurolemme ainsi que les principales trachées sont retirées soigneusement avec des pinces fines (Dumonstar #5, Dumont, Sarasota, USA). Le fait de retirer ces tissus permet d’avoir un accès aux différentes structures du cerveau et aussi de limiter l’auto-fluorescence. Une fois l’opération terminée, 20 µl de solution de Calcium Green 2AM sont déposés en bain sur le cerveau. Le Calcium Green est couramment utilisé au laboratoire pour suivre les variations de calcium intracellulaire au niveau du cerveau de l’abeille, afin de visualiser leur activation (Deisig et al., 2006 ; Sandoz et al., 2006 ; Hourcade et al., 2009).

Le Calcium Green 2AM (10 µg) (Molecular Probes, OR, USA) est dissous dans 4 µl d’un mélange d’acide pluronique F-127 (Molecular Probes, OR, USA) et de DMSO (20 %) et dilué dans 160 µl de solution saline (concentration finale 33 µM). Cette sonde fluorescente calcique est dite « mono émission, mono excitation », émettant un signal fluorescent (sous sa forme non AM) en réponse à une excitation de longueur d’onde 475 nm. Le signal émis est une lumière dont le pic de longueur d’onde est situé autour de 550 nm. L’intensité de cette fluorescence émise est multipliée par 100 lorsque la molécule se lie au calcium (Molecular Probes).

L’abeille fixée à son portoir est ensuite déposée sur un lit de glace pilée pendant une heure. Puis, le portoir est replacé à température ambiante et le surplus de sonde fluorescente est éliminé par trois lavages successifs avec de la solution saline.

Figure 26. Préparation des abeilles pour l’imagerie calcique. A) L’abeille endormie est placée sur

un portoir d’imagerie en plexiglas, les antennes vers l’avant. B) Objectif à immersion placé sur la préparation pour l’enregistrement du signal calcique. C) Zone de dissection avec les trois régions d’intérêt de la partie droite du cerveau: le lobe antennaire, le lobe alpha des corps pédonculés et le lobe protocérébral latéral. D) Représentation en 3D du cerveau de l’abeille (A, B : T. Franke. D :

http://www.neurobiologie.fu-berlin.de/beebrain/).

b. Procédure d’enregistrement des signaux calciques

L’abeille est ensuite placée sous l’objectif (UMPlan FL x10, immersion à eau, ouverture numérique : 0.3) d’un microscope droit à fluorescence (Olympus BX51WI) (figure 26B, 27A). Un monochromateur (Polychrome IV, TILL Photonics), équipé d’une lampe au xénon, est relié au microscope, et permet d’envoyer sur la préparation, une lumière de longueur d’onde précise (figure 27A). Le microscope est équipé d’une camera CCD (TILL IMAGO) 12 bits refroidie à -12°C, et reliée à un ordinateur. La caméra est pilotée avec le logiciel TILL Vision 4.0 (TILL Photonics, Munich, Allemagne). La mise au point est effectuée, via l’image de la caméra, sur la surface du cerveau et les variations de calcium au niveau de l’hémisphère droit sont enregistrées, en excitant la préparation avec une longueur d’onde de 475 nm et en mesurant l’émission au dessus de 515 nm (en passant par un miroir dichroïque à 505 nm et un filtre d’émission passe-haut à 515 nm, présents au niveau d’un cube filtre du microscope - voir principe figure 27B). Trois régions d’intérêt sont dessinées et enregistrées, correspondant à trois structures cérébrales : le lobe antennaire, le lobe alpha des corps pédonculés et le lobe protocérébral latéral (figure 26C et 26D).

Du fait des faibles niveaux de fluorescence enregistré, les enregistrements ce font avec un regroupement de pixels au niveau de la caméra (‘binning’) de 4 x 4. On sacrifie

donc la résolution de l’image afin d’obtenir des intensités de fluorescence mesurables. Le temps d’exposition est ajusté pour chaque préparation (entre 50 et 60 ms), de façon à obtenir un indice de fluorescence adapté aux capacités de la caméra (12 bits, 4096 niveaux de gris). Il doit être le plus important possible pour pouvoir révéler les signaux de manière la plus fine possible, mais sans toute fois risquer de saturer la caméra. Les expériences ont donc été réalisées avec un niveau moyen de fluorescence compris entre 2000 et 3000 à la surface des différentes structures enregistrées.

En tenant compte de ces paramètres, nous avons choisi d’enregistrer la fluorescence des trois régions d’intérêt toutes les 6 secondes (F ≈ 0,16Hz) pendant 60 minutes. Dix minutes après le début de l’enregistrement, 10 µl de caféine à 20 mM ou de solution saline sont ajoutés directement dans le bain de solution saline qui permet l’immersion de l’objectif. Ce volume a été choisi car le volume de solution saline qui permet l’immersion de l’objectif est de 200 µl, et que le volume d’hémolymphe présent dans le corps de l’abeille est d’environ 20 µl. Ainsi, la dilution de la solution de caféine injectée dans le cas des expériences de comportement (1µl à 20mM dans le thorax) est proche de celle obtenue dans cette expérience.

Figure 27. Dispositif pour l’imagerie calcique in vivo. A. Photographie du dispositif. L’abeille, dans

son portoir d’imagerie, est placée sous l’objectif d’un microscope à fluorescence. Une lumière provenant d’un monochromateur possédant une lampe au xénon est émise au travers du microscope pour aller exciter le Calcium Green présent au niveau du cerveau de l’abeille. De façon simplifiée, grâce au miroir dichroïque du microscope, l’émission de fluorescence du Calcium Green est enregistrée à l’aide d’une caméra CCD. Ces informations sont ensuite transmises à un ordinateur et analysé avec le logiciel TILL vision. B. Principe du fonctionnement du miroir dichroïque présent dans le microscope à fluorescence utilisé pour l’expérience d’imagerie calcique.

c. Analyse des données d’imagerie calcique

La fluorescence relative a été calculée avec l’équation suivante sur les trois régions enregistrées afin de présenter les résultats obtenus :

∆F / F = (Fn – F0) / F0

Avec Fn correspond à l’image de rang n et F0 la moyenne de la fluorescence

(référence) des 2 minutes qui précèdent l’injection de caféine ou de solution saline. Les données d’imagerie calcique seront représentées en %∆F/F.