Chapitre 2 : Criblage des gènes dont l’expression est dépendante

dans la formation de la mémoire olfactive à long terme

chez l’abeille.

Emmanuel Perisse, Jean-Christophe Sandoz, Isabelle Néant, Marc Moreau,

Catherine Leclerc et Valérie Raymond-Delpech.

Article en préparation

Université de Toulouse; UPS; Centre de Recherches sur la Cognition Animale (CRCA), 118 route de Narbonne, F-31062 Toulouse cedex 9, France

CNRS UMR 5169; Centre de Recherches sur la Cognition Animale (CRCA); F-31062 Toulouse, France

Université de Toulouse; UPS; Centre de Biologie de Développement (CBD), 118 route de Narbonne, F-31062 Toulouse cedex 9, France

CNRS UMR 5547; Centre de Biologie de Développement (CBD); F-31062 Toulouse, France

IV.3.1.

Introduction

Les résultats précédents suggèrent que le calcium joue un rôle essentiel dans la régulation de l’expression de gènes. En conséquence, le calcium pourrait être impliqué dans la synthèse de nouvelles protéines requises pour des modifications synaptiques nécessaires au stockage à long terme d’une information. Après l’apprentissage, l’expression des gènes se déroule en deux temps, l’expression des gènes précoces suivie de celle des gènes tardifs (Izquierdo et al., 2006 ; Laroche, 2006). De nombreuses études ont porté sur les gènes impliqués dans la formation de la mémoire à long terme (pour revues, Izquierdo et al., 2006 ; Miyashita et al., 2007). Ces études se sont principalement focalisées sur les gènes précoces (pour revue, Miyashita et al., 2007). En revanche, l’étude des gènes tardifs est récente et les résultats obtenus ne sont pas clairs (Dubnau et

al., 2003 ; Igaz et al., 2004a, b).

Nous avons donc choisi d’explorer et d’identifier l’expression de gènes tardifs dépendants d’une signalisation calcique qui sont nécessaires et suffisants pour la formation de la mémoire à long terme. Cette deuxième vague est plus spécifique de la formation de la mémoire à long terme que la première. En effet, certains gènes précoces peuvent être exprimés dans d’autres conditions que lors de la formation de la mémoire, comme par exemple dans l’adaptation, le stress ou l’attention (Clayton, 2000). De plus, nous avons montré, dans la partie précédente, qu’un blocage de la transcription 3 heures après un apprentissage en 3 essais espacés de 10 minutes induit une forte baisse des performances en mémoire à long terme.

IV.3.2.

Résultats

a. Criblage transcriptomique

Afin d’identifier ces gènes tardifs, nous avons réalisé des expériences de criblage transcriptomique à l’aide de la technique de puces à ADN dont le principe est présenté sur la figure 14 (voir Matériels et Méthodes paragraphe III.2.3). Nous emploierons le terme d’expériences de puces à ADN pour ces expériences. Ces expériences ont été réalisées avec des puces oligonucléotides représentant 95 % du génome de l’abeille soit, 10620 gènes. Lors de la dissection des cerveaux utilisés dans ces expériences, nous avons éliminé les lobes optiques du cerveau de l’abeille afin de garder une majorité de structures impliquées dans l’apprentissage olfactif (voir Introduction générale

paragraphes I.3.4).

Nous avons tout d’abord souhaité identifier les gènes impliqués dans la formation de la mémoire et exprimés entre 3 et 5 heures après l’apprentissage (correspondant à des

gènes tardifs). Nous avons comparé l’expression des gènes entre deux conditions (6 réplications biologiques). La première condition correspond à un groupe d’abeilles conditionnées en 3 essais espacés de 10 minutes dont on sait qu’elles forment une mémoire à long terme dépendante de la synthèse de nouvelles protéines (voir Résultats

IV.1.2.b). La seconde condition correspond à un groupe d’abeilles témoin pseudo-

conditionnées dont on sait qu’elles ne peuvent pas former une telle mémoire (Hourcade et

al., 2009). Nous avons donc prélevé le cerveau de ces deux groupes d’abeilles à 3, 4 et 5

heures pour réaliser une extraction d’ARN total. Puis, nous avons réalisé les expériences de puces à ADN.

L’analyse des résultats nous a permis d’identifier 246 gènes différentiellement exprimés entre les deux conditions et donc potentiellement impliqués dans la formation de la mémoire à long terme. La liste de ces gènes, leur régulation, leur valeur de p du test statistiques et leur rôle potentiel est présentée en annexe 5. Etant donné que le génome de l’abeille n’est pas complètement annoté, des similitudes ont été établies avec la drosophile. Ainsi, pour nos gènes d’intérêt et lorsque cette similarité est avérée, nous avons réalisé une recherche systématique avec Harverster III (http://harvester.fzk.de/harvester/). Si la comparaison de séquence avec la drosophile n’est pas démontrée, d’autres comparaisons de séquences ont été faites par BLAST (basic

local alignment sequence tool) avec les génomes du poisson zèbre, de la souris et de

l’Homme. A partir de ces analyses, le rôle potentiel de nos gènes d’intérêt peut être établi.

La figure 47 présente la distribution de ces 246 gènes par rapport à leur rôle potentiel au niveau cellulaire. Parmi ces gènes, 171 gènes sont surexprimés et 75 sont sous- exprimés. Ces gènes sont impliqués dans de nombreux processus biologiques et fonctions moléculaires comme par exemples, l’apprentissage et la formation de la mémoire, le métabolisme, le remaniement du cytosquelette… (figure 47). Le groupe présentant le plus de gènes différentiellement exprimés, correspond à celui de la régulation de la transcription et de la traduction. Dans ce groupe, 47 gènes sur 54 sont surexprimés dans nos conditions. Parmi ces gènes, on trouve des gènes similaires à des facteurs de transcription bien connus tels que atf2, nfat ou creb (voir Introduction générale

paragraphes I.1.2.b et I.2.3.d). Ces résultats confirment nos résultats comportementaux

avec l’ACT-D qui montrent qu’entre 3 et 5 heures après un apprentissage une importante transcription de gènes a lieu et est nécessaire pour la formation de la mémoire à long terme.

D’autres gènes surexprimés sont similaires à Dikar (une protéine de liaison à CREB) ou dCREB, gènes ayant un rôle bien démontré dans les processus d’apprentissage et de mémoire chez la drosophile (Dubnau et al., 2003b ; Keuling et al.,2007). Enfin, des gènes

surexprimés codant pour la Tubuline gamma et la dystrophine sont impliqués dans le remodelage du cytosquelette (Goldstein et Gunawardena, 2000).

Etant donné le rôle potentiel de ces gènes, ils pourraient participer aux modifications synaptiques structurales et fonctionnelles impliquées dans le stockage d’une information.

Figure 47. Résultats des expériences de puce à ADN pour l’étude des gènes impliqués dans la formation de la mémoire à long terme. 246 gènes sur les 10620 qui composent le génome de l’abeille

sont différentiellement exprimés entre un groupe qui a été soumis à un conditionnement permettant de former une mémoire à long terme et un groupe témoin pseudo-conditionné ne permettant pas de former une mémoire à long terme. Parmi ces gènes 171 sont surexprimés et 75 sous-exprimés. Ces gènes font partis de divers processus biologiques (en rapport avec leur similarité de séquence avec la drosophile) qui sont susceptibles d’être impliqués dans la formation de la mémoire à long terme.

Cette expérience de criblage transcriptomique a permis, pour la première fois sur ce modèle, d’identifier les gènes impliqués dans la formation de la mémoire olfactive à long terme chez l’abeille.

Afin d’identifier les gènes impliqués dans la formation de la mémoire à long terme et dont l’expression est dépendante du calcium, nous avons réalisé deux expériences de puces à ADN supplémentaires (figure 48). Les résultats comportementaux obtenus avec le BAPTA-AM (500 µM) et la caféine (20 mM) montrent que le calcium est nécessaire et suffisant pour la formation de la mémoire à long terme. Grâce à un criblage transcriptomique, ces deux groupes expérimentaux seront utilisés pour identifier respectivement, les gènes nécessaires et les gènes suffisants impliqués dans la formation de la mémoire à long terme et dont l’expression est régulée par un signal calcique. Un croisement du criblage des gènes différentiellement exprimés dans les trois expériences nous orientera ensuite vers des gènes candidats.

Figure 48. Représentation schématique des expériences de puce à ADN et des résultats attendus.

L’analyse des résultats, nous a permis d’identifier 179 gènes différentiellement exprimés entre le groupe injecté au BAPTA-AM (conditionné en 3 essais espacés de 10 minutes) et son groupe témoin (4 réplications biologiques) (détails en annexe 6), et 813 gènes entre le groupe injecté à la caféine (conditionné en 1 essai) et son groupe témoin (6 réplications biologiques) (détails en annexe 7). Cependant, dans ces expériences,

l’injection d’agent pharmacologique peut également entraîner une différence d’expression de gènes qui viendront donc s’ajouter à ceux présents dans les résultats.

Nous avons voulu savoir si les gènes identifiés comme étant requis pour la formation de la mémoire (expérience 1) pourraient être différentiellement régulés par des variations du niveau de calcium intracellulaire pendant l’apprentissage (expérience 2 et 3). Ainsi, nous avons croisé la liste de gènes identifiés dans la première expérience avec celles des deux autres expériences. Les résultats présentés en figure 49 montrent cependant qu’aucun gène n’est retrouvé dans les trois listes. En revanche, le croisement des listes deux à deux (figure 49), indique que plusieurs gènes communs sont différentiellement exprimés (détails en annexe 8).

Pour le croisement entre la liste « mémoire à long terme » et la liste « BAPTA-AM », on observe trois gènes en commun. Notre hypothèse est que les gènes surexprimés lors de la formation de la mémoire à long terme seraient sous-exprimés ou ne présenteraient pas de variation d’expression après un traitement au BAPTA-AM et inversement. Cependant, sur les 3 gènes en commun, seulement deux vont dans le sens de notre hypothèse.

Pour le croisement entre la liste « mémoire à long terme » et la liste « caféine », on observe 23 gènes en commun. Notre hypothèse est que les gènes surexprimés lors de la formation de la mémoire à long terme seraient également surexprimés après un traitement à la caféine et inversement Les résultats obtenus ne confirment pas notre hypothèse étant donné que sur ces 23 gènes l’expression de 18 gènes va dans le sens opposé.

Enfin, dans le croisement entre la liste « BAPTA-AM » et la liste « caféine », 9 gènes sont en commun. Notre hypothèse est que les gènes surexprimés en caféine lors de la formation de la mémoire à long terme seraient sous-exprimés après un traitement au BAPTA-AM et inversement. Dans ce cas, 8 gènes sur 9 vont dans le sens de notre hypothèse.

Figure 49. Diagramme de Venn correspondant au croisement des listes de gènes obtenus après l’analyse des résultats de trois expériences de puce à ADN. Ce diagramme permet d’identifier les gènes

nécessaires et suffisants impliqués dans la formation de la mémoire à long terme et dont l’expression est dépendante du calcium. MLT : mémoire à long terme.

Les expériences de criblage transcriptomique ont, pour la première fois sur ce modèle, permis d’identifier 246 gènes potentiellement impliqués dans la formation de la mémoire olfactive à long terme chez l’abeille (expérience 1). Grâce aux expériences 2 et 3, nous avons identifié des gènes potentiellement impliqués dans la formation d’une mémoire olfactive à long terme et dont l’expression est dépendante du calcium. Cependant, les croisements des résultats de ces trois expériences ne nous permettent pas de conclure sur l’implication de gènes dont l’expression est dépendante du calcium et impliqués dans la formation de la mémoire à long terme.

b. RT-PCR quantitative

Etant donné que les croisements des résultats de criblage ne nous permettent pas de choisir des gènes candidats dont l’expression est régulée par le calcium et impliqués dans la formation de la mémoire à long terme, nous avons choisi une autre stratégie de recherche. Ainsi, afin de mieux appréhender le phénomène qui nous intéresse, nous avons

choisi des gènes candidats impliqués dans la formation de la mémoire à long terme, à partir de l’expérience 1. La technique de RT-PCR quantitative permettra de quantifier le niveau d’expression de ces gènes dans les trois comparaisons précédement utilisées lors des expériences de puces à ADN.

Des gènes candidats sont choisis à partir des résultats de l’expérience 1, en fonction de 3 critères :

- Leur rôle potentiel est connu chez la drosophile ou des gènes inconnus - Leur niveau d’expression (> à 1,3 ou < 0,8)

- Leur probabilité de différence d’expression entre les deux conditions (valeur p du test de Student)

Les 10 gènes choisis sont présentés en figure 50 (et plus en détails en annexe 9). Parmi ces 10 gènes, le gène BI515707 est aussi statistiquement différentiellement exprimé dans l’expérience 2, et les gènes LOC411508 et GB18593-RA le sont dans l’expérience 3. Ainsi, nous pourrons également vérifier les différences d’expression observées entre expériences.

Figure 50. Tableau des 10 gènes candidats choisis à partir des expériences de puce à ADN. *gènes

également différentiellement exprimés dans l’expérience 2 (BI515707) et dans l’expérience 3 (LOC411508 et GB18593-RA). La valeur de p correspond à celle obtenue après le test de Student des données de puce à ADN.

Pour ces 10 gènes candidats, nous avons ensuite quantifié leur expression au sein de chaque condition afin de les comparer. Nous pourrons ainsi faire un parallèle entre la quantification de gènes dans nos échantillons et la quantification obtenue avec les résultats de puce à ADN. Des expériences sur l’efficacité des amorces choisies, pour l’amplification de chaque gène, nous ont permis de sélectionner que 5 gènes sur les 10 prévus initialement.

Pour les 5 gènes dont les amorces sont efficaces (figure 51), la quantification a été réalisée pour les comparaisons suivantes :

- Conditionnées vs pseudo-conditionnées - BAPTA-AM vs témoin,

- Caféine vs témoin.

Figure 51. Liste des gènes candidats dont l’efficacité des amorces a été approuvée. Des

informations concernant la régulation et la valeur de p du test statistiques de Student effectuées sur les trois expériences de puce à ADN. Parmi ces 5 gènes, pigeon code pour une protéine dont la fonction est inconnue , la tubuline gamma joue un rôle dans le remaiement du cytosquelette (Goldstein et Gunawardena, 2000) et la protéine 14 d’interaction avec huntingtine est impliquée dans la transmission synaptique (Ohyama et al., 2007) (X : non applicable).

Les expériences de RT-PCR quantitative que nous avons effectuées nous donnent des informations de quantification relative d’expression des gènes. En effet, pour chaque comparaison, nous avons choisi deux gènes de références dont nous avons vérifié au préalable qu’ils sont en quantité identique dans chaque condition (voir en détails

Matériels et Méthodes paragraphes III.2.4.b). Ensuite, pour chaque condition, nous

avons évalué la quantité de chaque gène candidat relative à celle de chaque gène de référence choisi. Ces gènes de références sont spécifiques à chaque comparaison. Nous

avons donc sélectionné les gènes de référence Rps5 et Rps8 pour la comparaison conditionnées vs pseudo-conditionnées, Rps18 et Rps5 pour la comparaison BAPTA-AM

vs témoin, et Rps18 et Rps5 pour la comparaison caféine vs témoin.

Les résultats de RT-PCR quantitative, après 3 réplications biologiques et 3 réplications techniques, montrent que les 5 gènes candidats sont exprimés différemment pour chaque comparaison (figure 52A). Les résultats de RT-PCR quantitative reproduisent les résultats obtenus avec les puces à ADN pour 6 gènes sur 7 dans les expériences de comparaison conditionnées vs pseudo-conditionnées et BAPTA-AM vs témoin. En revanche, pour la comparaison caféine vs témoin les expériences de puces à ADN diffèrent des expériences de RT-PCR quantitative (figure 52B). Il est important de noter que dans les conditions BAPTA-AM et caféine, l’expression d’un seul gène a été comparée.

Parmi les résultats obtenus (figure 52A), celui du gène Tubuline Gamma peut retenir notre attention. En effet, il est surexprimé dans la comparaison conditionnées vs pseudo- conditionnées, sous-exprimés dans la comparaison BAPTA-AM vs témoin et surexprimé dans la comparaison caféine vs témoin ce qui correspond à nos prédictions. De plus, il n’y a pas de différence de niveau moyen d’expression de Tubuline Gamma entre les comparaisons conditionnées vs pseudo-conditionnées et caféine vs témoin (t = 0,22 ; p = 0,82). En revanche, il y a une différence entre les comparaisons conditionnées vs pseudo- conditionnées et BAPTA-AM vs témoin (t = -2,75 ; p = 0,02), ainsi qu’entre les comparaisons caféine vs témoin et BAPTA-AM vs témoin (t = -6,2 ; p < 0,001).

Figure 52. Quantification relative des 5 gènes candidats pour les trois conditions. A. Niveau

d’expression moyen (± SEM) relatif des 5 gènes candidats par rapport à leur groupe témoin respectif. Parmi ces gènes, BI515707, Protéine d’interaction avec Huntingtine, LOC412000 et Tubuline Gamma sont surexprimés pour la comparaison conditionnées vs pseudo-conditionnées et le gène Pigeon ne varie pas. Pour la comparaison BAPTA-AM vs témoin, le gène Pigeon est surexprimé et les 2 gènes BI515707 et

Tubuline Gamma sont sous-exprimés. LOC412000 Enfin, pour la dernière comparaison caféine vs témoin

les 3 gènes BI515707, Protéine d’interaction avec Huntingtin et Pigeon sont sous-exprimés, le gène

LOC412000 ne varie pas et le gène Tubuline Gamma est surexprimé. B. Niveau d’expression moyen (±

SEM) des 5 gènes candidats entre les expériences de puces à ADN et les expériences de RT-PCR quantitative. On peut voir que pour la comparaison conditionnées vs pseudo-conditionnées et la comparaison BAPTA-AM vs témoin, les variations d’expression des gènes sont identiques entre les deux techniques. En revanche, pour la comparaison caféine vs témoin, l’expression du gène Tubuline Gamma est différente entre les deux techniques. (MLT : mémoire à long terme ; * : p <0.05 ; ** : p<0.01 ; * : p< 0.001 ; NS : non significatif).

Les résultats de ces expériences de RT-PCR quantitative montrent que la variation de l’expression de ces gènes que nous avons identifié dans les expériences de puces à ADN est identique pour les comparaisons conditionnées vs pseudo-conditionnées et la comparaison BAPTA-AM vs témoin (figure 52B). En revanche, elle n’est pas retrouvée dans la comparaison caféine vs témoin. Cependant, cette comparaison a été réalisée sur un seul gène. La quantification relative par RT-PCR quantitative valide en première instance les résultats de puces à ADN pour les différentiels conditionnées vs pseudo- conditionnées et BAPTA-AM vs témoin. Nous devons rester plus circonspects pour l’expérience de puces avec la caféine. Cependant, d’autres résultats, comme celui de la régulation différentielle de Tubuline Gamma entre les 3 différentes comparaisons, nous permettent d’argumenter en faveur de notre hypothèse. Ce gène pourrait donc être identifié comme un des gènes calcium-dépendant, nécessaire et suffisant pour la formation de la mémoire à long terme.