Agents pharmacologiques utilisés pour le comportement

a. Modes d’injection des agents pharmacologiques

Les différents agents utilisés dans les expériences comportementales sont injectés avec une seringue (Modèle World Precision Instruments, USA) de 10 µl. Pour chaque expérience, un volume de 1 µl est injecté dans le thorax (figure 21A). Pour l’expérience réalisée avec le produit encagé (voir Matériels et Méthodes paragraphe III.1.4), le même volume est ajouté à l’hémolymphe du cerveau, la capsule céphalique ayant été ouverte (figure 21B).

Figure 21. Mode opératoire des différentes injections. A. Injection d’1 µl d’agent pharmacologique

dans la partie externe du thorax de l’abeille en contention. B. Ajout d’1 µ l d’agent pharmacologique à l’hémolymphe directement au niveau du cerveau de l’abeille.

b. Contrôle de l’inhibition de l’augmentation de la [Ca2+]i

Afin d’empêcher l’augmentation de la [Ca2+]i, nous avons utilisé un chélateur calcique intracellulaire, le BAPTA-AM (1,2 - bis - (o - Aminophenoxy) - ethane - N,N,N',N' - tetraacetic acid, tetraacetoxymethyl ester) (Molecular Probes, USA). Un volume de 1 µl de BAPTA-AM est injecté dans le thorax à la concentration de 50 ou 500 µM une heure avant le début ou une heure après la fin d’un conditionnement en trois essais espacés de 10 minutes.

Le BAPTA-AM est lipophile et passe donc au travers de la membrane plasmique pour ensuite, dans le milieu intracellulaire, interagir avec des estérases entraînant le clivage du groupement AM de la molécule. La molécule devenue alors hydrophile peut jouer son rôle de chélateur calcique, bloquant ainsi les augmentations du niveau de calcium intracellulaire qui proviennent soit d’une entrée de calcium extracellulaire par des canaux ou récepteurs soit de la libération de calcium des stocks intracellulaires (Tsien, 1980).

c. Contrôle de l’augmentation de la [Ca2+]i

L’augmentation de la [Ca2+]i a tout d’abord été réalisée avec de la caféine (Sigma-

Aldrich, France). En effet, la caféine permet, par interaction avec les récepteurs à la ryanodine présents sur le réticulum endoplasmique (RE), de libérer du calcium de ce dernier vers le cytoplasme et ainsi augmenter la [Ca2+]i (McPherson et al., 1991). Un volume de 1 µl de caféine à 20 mM est injecté dans le thorax des abeilles 20 minutes avant le début, immédiatement après ou 1 heure après un conditionnement en un seul essai. La concentration de caféine a été choisie d’après l’article de Si et al. (2005) dans lequel l’effet de différentes concentrations de caféine, en application topique à l’émergence des abeilles, a été testé sur les performances d’apprentissage et de mémoire à

différents âges. Pour des concentrations comprises entre 10 et 100 mM en application topique, la caféine entraîne une augmentation significative des performances de mémoire chez des abeilles traitées 4 jours avant. Dans nos expériences comportementales, nous appliquons la caféine en injection intra-thoracique. Nous avons donc choisi une concentration plus faible que celle choisi par Si et al. (2005), soit 20 mM.

La caféine a un effet sur la libération du calcium (McPherson et al., 1991) mais elle pourrait avoir des effets latéraux que nous n’avons pas examinés dans nos expériences (Vaugeois, 2002 ; Lorist et Tops, 2003). Nous avons donc testé l’effet d’agents pharmacologiques plus spécifiques du calcium intracellulaire, l’ionomycine (Molecular probes, USA) et le NP-EGTA-AM (Molecular probes, USA).

L’ionomycine est un ionophore calcique qui va interagir avec la membrane plasmique et ainsi former des pores aux travers desquels le calcium va pouvoir passer sélectivement selon son gradient électrochimique. Etant donné que la [Ca2+] extracellulaire est de 10-3 M et que la [Ca2+]i est de 10-7 M (Simons, 1988), le calcium va entrer dans le milieu intracellulaire et ainsi augmenter la [Ca2+]i. Nous avons testé cet agent pharmacologique à la concentration de 20 mM en injectant 1 µl dans le thorax des abeilles 20 minutes avant un conditionnement en un essai.

Nous avons aussi testé un donneur de calcium encagé, le NP-EGTA-AM (O- Nitrophenyl EGTA acetoxymethyl ester) (figure 22) à 20 mM. Le NP-EGTA-AM est ajouté (1 µl) directement à l’hémolymphe du cerveau des abeilles une heure avant le début du conditionnement. Le mode d’action de cet agent est décrit en figure 25.

Figure 22. Schéma de la molécule de NP-EGTA-AM. Les groupements acétoxyméthyles (AM), qui

permettent une action intracellulaire de l’agent pharmacologique, sont symbolisés par les rectangles. Lors d’une exposition aux ultra-violets, la molécule va être photoclivée au niveau de la liaison entre le noyau aromatique et la molécule d’azote (N) et ainsi diminuée drastiquement son affinité pour le calcium. Ca2+ : calcium.

d. Inhibition de la synthèse protéique de novo

Dans nos expériences comportementales, nous souhaitons inhiber la synthèse protéique de novo. Pour ce faire il existe deux possibilités : soit inhiber la traduction des ARN messagers déjà présents ou nouvellement transcrits, soit bloquer la transcription. Pour être plus précis, nous avons donc choisi un inhibiteur de transcription, l’actinomycine-D (Sigma-Aldrich, France). Ce composé est utilisé à 1,5 mM et est injecté trois heures après la fin du conditionnement. Des expériences réalisées au laboratoire ont montré que l’injection d’actinomycine-D trois heures après le conditionnement entraîne la baisse la plus importante des performances de MLT à 72 heures (Jean-Marc Devaud, communication personnelle).

e. Préparation des solutions

Le BAPTA-AM et le NP-EGTA-AM sont dissous dans du DMSO (diméthylsulfoxyde) (Sigma-Aldrich, France) à 0,5 % final puis dilués dans de la solution saline (130 mM NaCl, 6 mM KCl, 4 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, 160 mM sucrose, 25 mM

glucose et 10 mM HEPES, pH 6,7). La caféine est diluée uniquement dans la solution saline. L’actinomycin-D est diluée dans une solution de tampon phosphate (PBS (« phosphate buffer saline ») 1X). Les groupes témoins ont été injectés avec le même volume de solution et avec la même concentration de DMSO que les groupes expérimentaux.

f. Composés possédants un groupement acétoxy-méthyl (AM)

Le groupement acétoxy-méthyl (AM) de certains produits utilisés permet d’avoir un effet spécifique au niveau intracellulaire. En effet, le BAPTA-AM, le NP-EGTA-AM et le Calcium Green 2AM (voir Matériels et Méthodes paragraphes III.1.5) n’ont aucun effet sur le calcium tant qu’ils sont sous cette forme estérifiée avec leur groupement AM. Ce n’est qu’à partir du moment où il rentre dans les cellules que des estérases endogènes vont cliver ce groupement AM et ainsi libérer les sites de liaison au calcium. Couramment utilisé chez l’abeille, ce type de produit a un effet maximum au niveau intracellulaire environ une heure après son injection (Sandoz et al., 2006).