Foi realizada segundo metodologia proposta por Engel, Bahr e Schieberle (1999) e consiste na utilização de uma unidade de destilação compacta ligada a uma bomba de vácuo (FIGURA 2) que juntas permitem uma separação com alto rendimento dos compostos de
frutas. Esta técnica é conhecida pela sigla SAFE do inglês Solvent Assisted Flavour Evaporation.
Figura 2 - Equipamento do Solvent Assisted Flavour Evaporation.
Fonte: A Autora (2014).
Inicialmente foi realizada a centrifugação de 100 mL de polpa de pitanga roxa a 1000 x g durante 5 minutos para remoção de partículas que poderiam interferir na realização do SAFE. A partir do sobrenadante obtido desta centrifugação foi realizado o SAFE e, como resultado final, foram obtidas duas frações, uma onde se encontram os compostos voláteis (água destilada, AD) e a outra contendo a fração não volátil (matéria seca, MS). O rendimento de cada fração foi determinado pelo peso.
3.2.3.2 Identificação e quantificação 3.2.3.2.1 Compostos voláteis
Na solução contendo a água destilada e a fração volátil foram adicionados 140 mL de dietil éter, transferindo-se quantitativamente para um funil de separação de 250 mL. Realizou-se a homogeneização da solução e em seguida foi colocado em descanso até que as duas fases se separassem. Recolheram-se cada uma das duas fases em Erlenmeyers distintos. Na fase inferior foi repetido o procedimento quatro vezes. As fases superiores obtidas das
cinco lavagens (fase orgânica) foram combinadas em um único Erlenmeyer, pulverizada com sulfato de sódio anidro e filtrada diretamente em um balão de fundo redondo para posterior remoção do solvente em rotaevaporador (450 mbar a 40°C). Todo procedimento foi realizado conforme descrito por Ehrnhöfer-Ressler et al. (2013).
Os compostos voláteis foram analisados por cromatografia gasosa. Utilizou-se o cromatógrafo gasoso (GC-MS) Agilent Technologies 6890N Network (Agilent Techologies, Vienna, Austria), acoplado ao espectrômetro de massa Agilent 5973 Network (Agilent Techologies, Vienna, Austria) que foi operado em modo de impacto de elétrons (EI) a 70 eV. O volume de 1 µL da amostra foi injetado a 250°C no modo splitless pulsado com temperatura da coluna de 50°C. A temperatura de injeção foi mantida durante 2 minutos seguida de aquecimento até 280°C em 15 minutos. O gás de arraste utilizado foi o hélio, o qual foi utilizado a uma taxa de fluxo constante de 1,1 mL/minuto. A coluna utilizada foi a DB-5MS, 30 m de comprimento, 0,250 mm de diâmetro e 0,25 µm de espessura.
Os compostos foram identificados com base em seus padrões de fragmentação em espectrofotometria de massa usando o banco de dados ChemStation G1707 (Agilent Technologies, Viena, Áustria) e com o estudo de Weyerstahl et al. (1988) que identificaram os compostos voláteis presente no óleo extraído das folhas da pitangueira.
Após a identificação dos picos, escolheu-se o composto presente em maior quantidade na fração volátil da polpa de pitanga roxa para realizar a sua quantificação. Este composto não foi encontrado disponível para compra e sua síntese é muito onerosa, fazendo- se necessário isolar este composto diretamente da polpa de pitanga roxa. Tomou-se 100 mL de polpa de pitanga roxa, adicionou-se 140 mL de dietil éter. A mistura foi transferida pra um funil de separação de 250 mL, e esperou-se a sua separação em duas fases que foram recolhidas em Elenmeyers distintos. Na fase inferior foi repetido o procedimento quatro vezes. As fases superiores foram combinadas, pulverizada com sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada em rotaevaporador a 450 mbar a 40°C até um volume final de 1 mL. A solução foi evaporada com nitrogênio gasoso, o resíduo foi diluído em 0,5 mL de acetonitrila e em seguida injetado em UHPLC (Dionex Ultimate 3000 series UHPLC system) conectado a um detector de arranjo de diodos (Dionex, Austria). A separação cromatográfica a 25°C foi realizada utilizando a coluna Luna® C18 LC (5 µm, 100 , 250 x 3 mm, Phenomenex) usando as seguintes condições: C (acetonitrila) e D (água destilada) com velocidade de fluxo de 0,5 mL/min. Um gradiente linear foi programado como descrito a seguir: 0-25 min – 40% C; 25- 30 min – 40-100% C; 30-35 min – 40% C. Os picos foram coletados usando o Chromeleon 6.8 software (Dionex, Austria). A absorbância dos picos foi monitorada a 190 nm. Após a
coleta dos picos foi realizada a identificação dos mesmos em GC-MS usando as mesmas condições descritas na etapa de identificação dos picos.
O composto desejado foi concentrado utilizando o nitrogênio gasoso. Em seguida foi diluído com acetonitrila e a confirmação de sua identidade e pureza foi realizada utilizando a ressonância nuclear magnética (RNM) comparando o resultado com o trabalho de Weyerstahl et al. (1988). Após esta confirmação foi realizada a quantificação desse composto. A quantificação foi realizada em LC-MS 2020 (Shimadzu Corporation, Japan) usando o mesmo gradiente linear usado para isolar o composto em UHPLC. A coluna utilizada foi a Luna 5 u C-18(2) 100 , 250 x 3,00 mm, 5 µm (Phenomenex). A quantificação foi realizada com o comprimento de onda de 190 nm e foi baseada na área do pico, usando uma curva padrão de cinco pontos preparada com o composto isolado. Os resultados foram expressos em µg/mL de polpa de pitanga roxa.
3.2.3.2.2 Compostos não voláteis
Sabendo que a pitanga roxa é rica em flavonoides (MALAMAN et al., 2011; LIMA, MÉLO, LIMA, 2002), optou-se por fazer a identificação destes compostos neste fruto. A extração dos flavonóides foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Celli, Pereira-Netto e Beta (2011). À fração não volátil obtida após o SAFE foi adicionado 40 mL da solução acetona/água/ácido acético (70:29:1, v/v/v), seguido de sonificação durante 1 hora à temperatura ambiente, centrifugação a 4500 x g, durante 25 minutos a 20°C e filtração em um filtro de seringa PVDF com poro de 0,45 m e diâmetro nominal de 13 mm (Rotilabo®, Germany). A amostra foi injetada em cromatógrafo líquido acoplado a um espectrofotômetro de massa (LC-MS 2020, Shimadzu Corporation, Japan) usando a coluna Luna 5 u C-18(2) 100 , 250 x 3,00 mm, 5 µm (Phenomenex). A amostra foi eluída pela coluna com um gradiente consistindo de A (0,3% de ácido fórmico em água, v/v) e B (0,3% de ácido fórmico em metanol, v/v) com uma taxa de fluxo constante de 0,5 mL/min. O gradiente linear foi programado como descrito a seguir: 0-1,5 min – 5% B; 1,5-4 min – 5-10% B; 4-10 min – 10- 15% B; 10-15 min – 15-50% B; 15-20 min – 50-5% B, similar ao descrito por Celli, Pereira- Netto e Beta (2011). O LC-MS foi utilizado no modo positivo.
Os compostos foram identificados através da comparação com o espectro dos compostos em outros artigos e com trabalho de Celli, Pereira-Netto e Beta (2011). Após a identificação dos flavonóides, optou-se por realizar a quantificação do composto majoritário observado neste fruto. Este composto foi a cianidina-3-glicosídeo (C3G). Para construção da
curva padrão e posterior quantificação, obteve-se este produto na empresa Polyphenols Laboratories AS com pureza de 99,9%.
A quantificação foi realizada com comprimento de onda de 350 nm e foi baseada na área do pico usando uma curva padrão de cinco pontos preparada com a solução padrão de cianidina-3-glicosídeo clorídrica (Polyphenols Laboratories AS). Os resultados foram expressos em µg/mL de polpa de pitanga roxa.
3.2.4 Experimento com células HGF-1