GLIC
3.3.1 Caractérisations fonctionnelles
L’analyse des structures GLICpH7 et GLICpH4 révèle une interaction entre les résidus F195 situé en haut de M1 et M252 située sur la boucle M2-M3 (Figure 1).
La mutation F195A résulte en un phénotype perte de fonction fort avec des courants à la membrane ne dépassant pas 1*A contre 8*A pour le récepteur sauvage (Figure 2 et Table 1). Notons que les faibles courants observés à bas pHs peuvent être dus à l’activation de canaux endogènes des ovocytes, régulièrement observés sur des ovocytes non injectés. Ainsi, il est possible que le mutant Y195A ne produise en réalité aucun courant à la membrane.
Figure 2 : Caractérisations du mutant F195A. Gauche : Tracé électrophysiologique du mutant. Droite : Clichés de microscopie à fluorescence d’ovocytes exprimant diverses constructions. L’anticorps anti-HA (rouge) est dirigé contre un tag situé en C-ter de la séquence de GLIC. La GFP est co-injectée avec les mutants comme contrôle d’injection. La barre d‘échelle représente 50*M.
Des tests d’immuno-marquages réalisés sur des ovocytes exprimant le mutant montrent une expression robuste des récepteurs à la membrane,
suggérant que la faiblesse (ou l’absence) des courants est due à une faible probabilité d’ouverture (Figure 2).
Mutant pH50 nH Imax (µA) n
GLIC sauvage 5,3±0,2 1,29±0,06 6±1 4
F195A ND ND <1 3
Q193C 5,0±0,1 1,6±0,4 5±1 3
Q193M 4,53±0,02 2,39±0,09 0,7±0,1 3
Q193L 4,48±0,05 2,8±0,5 1,2±0,3 3
Table 1 : Caractéristiques fonctionnelles des mutants du pré-M1. Les barres d’erreur représentent l’écart-type. ND : non déterminable.
Les mesures électrophysiologiques réalisées dans le cadre de l’étude de GLIC par fluorescence ont montré que la position Q193C (pré-M1) (Figure 1) n’était plus, ou faiblement, activable suite à la liaison avec le methyl methanethiosulfonate (MMTS). Ce phénotype a été exploité pour les études de marquage au bimane, mais j’ai également cherché à mimer la fixation du MMTS par une mutation en méthionine. Comme attendu, la mutation Q193M provoque une forte perte de fonction des récepteurs avec un pH50=4,5 et des courants de très faible amplitude (Imax=0,7±0,1)
(Table 1). De même, la mutation Q193L est caractérisée par un pH50=4,5
avec, toutefois, des courants légèrement plus grands (Imax=1,2±0,3) (Table 1). Ces données montrent qu’un résidu hydrophobe à la position 193 provoque un fort phénotype perte de fonction.
La glutamine 193 étant proche de la boucle M2-M3, j’’ai également testé le double mutant P250C-Q193C dans le but de lier de façon covalente, par un pont disulfure, le pré-M1 à la boucle M2-M3 de la sous-unité adjacente. Ce mutant est constitutivement ouvert, avec des courants de fuite allant jusqu’à 1µA (Figure 3). Ces courants sont bloqués par le bloquant du canal picrotoxine, suggérant qu’ils sont dus à l’ouverture des canaux de GLIC, mais le traitement par le DTT des ovocytes ne permet pas de refermer les canaux. De plus, les courants enregistrés suite à des
applications d’agoniste sont presque toujours inférieurs à 1*A rendant toute analyse difficile.
Figure 3 : Ouverture spontanée du mutant Q193C-P250C. Le tracé électrophysiologique montre le courant de fuite enregistré en absence d’agoniste. La flèche VC indique le point d’imposition d’un voltage membranaire (-40mV) permettant de visualiser les courants à la membrane. Dans cet enregistrement la picrotoxine est appliquée en tant que bloqueur du canal pour attester que les courants enregistrés sont portés par GLIC, les courants endogènes à l’ovocyte n’étant pas sensibles à ce bloquant.
3.3.2 Structures des mutants du pré-M1
Les mutants générés à la position Q193 montrant des phénotypes intéressants, ils ont été cristallisés (Haidai Hu et Marc Delarue).
De façon intéressante, l’inspection de la région du pré-M1 dans la
structure GLICpH4 sauvage montre un réseau d’interactions où la chaine
latérale du Q193 contacte deux molécules d’eau structurées, qui à leur tour contactent soit la boucle M2-M3, soit la boucle F (Figure 4A).
La résolution de la structure du mutant Q193C, dont la fonction est identique au récepteur sauvage, montre un réseau d’interaction similaire. Cependant, la chaine latérale du Q193C apparaît déplacée vers le bas, s’éloignant de la molécule d’eau supérieure et se rapprochant de la proline 250, suggérant une interaction directe des deux positions (Figure 4A).
Figure 4 : Structures de GLIC Q193C. A : Zoom sur l’interface ECD/TMD. Gauche : structure de GLICpH4 sauvage. Droite : structure de GLIC Q193C. Les traits pointillés indiquent les interactions potentielles entre résidus et molécules d’eau (croix rouges). B : vue de deux sous-unités de GLIC au niveau du pore pour le mutant Q193C (vert) et Q193C-MMTS (bleu). Les hélices M2 formant le pore, dans des conformations différentes entre les deux structures, sont colorées en rouge. Cette figure m’a été fournie par Haidai Hu.
En revanche, la structure du Q193C lié au MMTS et les structures des mutants Q193L et Q193M montrent toutes une conformation de type LC1 présentant un ECD dans une conformation active, et un TMD dans une conformation de repos (Figure 4B et Table 2).
L’examen de la région du pré-M1 de ces mutants montre que la chaine latérale en position 193 est déplacée vers l’extérieur de la protéine (Figure 5), perturbant le réseau d’interaction avec la boucle M2-M3. .
Figure 5 : Structure de GLIC Q193M. A : Zoom sur le pré-M1 de GLIC sauvage pour rappel des interactions effectuées par le réseau de molécules d’eau. B : Zoom sur le pré-M1 de GLIC Q193M (vert) superposé à la structure de GLIC sauvage (rouge). La flèche indique le mouvement effectué par la chaine latérale de la position 193.
Ces données suggèrent donc un rôle critique de l’interaction pré-M1/boucle M2-M3 dans la stabilisation de l’état ouvert. Cette idée est par ailleurs renforcée par le phénotype du double mutant P250C-Q193C qui est constitutivement actif (Figure 12).
Mutant Conditions de cristallisation et
conformation Q193C pH4 – active Q193C-MMTS pH4 – LC1 Q193M pH4 – LC1 Q193L pH4 – LC1 P250C-Y197F pH4 – LC1
Table 2 : Structures des mutants de GLIC.
Certains des mutants de M1 montrent également des phénotypes intéressants pour la désensibilisation de GLIC ; ces données sont présentées dans les parties suivantes. Le pré-M1/M1 ayant ainsi un rôle dans l’activation et la désensibilisation, les données des deux parties seront discutées ensemble à la fin de ce chapitre.