Généralités sur les enzymes

Les enzymes sont des protéines fonctionnelles, de masse moléculaire élevée, thermolabiles. Ce sont des biocatalyseurs des réactions métaboliques. Elles augmentent la vitesse de réaction sans modifier leur état d’équilibre et sont régénérées à la fin du cycle réactionnel. Elles agissent à de faibles concentrations, possèdent une spécificité étroite ou lâche avec le substrat.

II.1.1 Structure

Les enzymes sont des protéines, des macromolécules constituées de chaînes d’acides aminés. Les acides aminés sont des molécules polyfonctionnelles qui comportent au moins une fonction acide carboxylique et une fonction amine portées par le même carbone. Il existe 20 acides aminés courants qui se différencient par la nature de la chaîne latérale, leur comportement hydrophile ou hydrophobe, leur propriété de charge électrique.

Les acides aminés se relient entre eux grâce à des liaisons peptidiques qui se forment par condensation entre le groupe α-carboxylique du premier acide aminé et la fonction α-aminée de la deuxième molécule avec élimination d’une molécule d’eau.

+H3N-CH(R1)-COO^- + ⁺H3N-CH(R2)-COO^-→ ⁺H3N-CH(R1)-CO-HN-CH(R2)-COO^- + H2O

Quand deux acides aminés se réunissent, ils forment un peptide. Si la chaîne s’agrandit, on parle d’oligopeptides puis de polypeptides lorsqu’on dépasse 20 acides aminés. A ce niveau là, la macromolécule se définit comme une protéine. De plus, les interactions faibles telles que des liaisons hydrogène, des interactions électrostatiques, de type Van der Waals, hydrophobes entre les différents acides aminés entraînent le repliement de la molécule (Figure 4). On passe alors d’une structure primaire (chaîne d’acides aminés) à une structure secondaire. A ce niveau d’organisation, il existe deux types de conformations : l’hélice alpha et le feuillet bêta. L’hélice alpha est composée d’une chaîne d’acides aminés en spirale. Le feuillet bêta est composé de chaînes disposées parallèlement les unes par rapport aux autres et formant une membrane plissée. La forme finale, qu’adopte une protéine suivant une structure tridimensionnelle, est appelée structure tertiaire. La structure quaternaire est l’association de plusieurs polypeptides. Les enzymes se différencient par leur séquence d’acides aminés qui leur sont propres et leur structure est due à la

nature de ces unités. En effet, les molécules hydrophobes ont tendance à se replier à l’intérieur de la protéine alors que les groupements moléculaires facilement ionisables et hydrophiles s’orientent préférentiellement à la surface de la macromolécule, en interaction avec le milieu aqueux environnant. Hélices alpha Feuillet bêta Structure tridimensionnelle Structure primaire + -O ---H

Structure secondaire _{Structure tertiaire}

Hélices alpha Feuillet bêta Structure tridimensionnelle Hélices alpha Feuillet bêta Structure tridimensionnelle Structure primaire + -O ---H + -O ---H

Structure secondaire _{Structure tertiaire}

Figure 4 : Les différents niveaux de structuration des protéines

Les enzymes sont des molécules amphotères, elles peuvent être chargées positivement, négativement ou être électriquement neutre selon le pH de la solution dans laquelle elles se trouvent. La charge nette d’une protéine est la somme des charges positives et négatives de ses extrémités et des chaînes latérales des acides aminés qui la composent. Le point isoélectrique (p.i.e) correspond au pH où la charge nette de la molécule est égale à 0. Les protéines sont alors chargées positivement quand pH<p.i.e et négativement pour pH>p.i.e.

La nature des différents acides aminés qui la compose influence les propriétés de l’enzyme au niveau de son encombrement stérique, de son point isoélectrique (c'est-à-dire de son comportement basique ou acide), de l’affinité vis-à-vis de l’eau (plutôt hydrophile ou hydrophobe) et de la réactivité du site actif. La rétention des protéines peut avoir lieu sur des matrices chargées positivement ou négativement, dans les conditions où le pH d’utilisation entraîne une opposition de charges entre l’enzyme et le solide.

II.1.2 Activité

Une enzyme est¹², une protéine qui agit comme catalyseur dans une réaction chimique, c'est-à-dire qu’elle accroit les vitesses réactionnelles. L’énergie d’activation de la réaction est alors abaissée. Chaque enzyme « reconnaît » spécifiquement une ou plusieurs molécules selon un principe de complémentarité de type clé-serrure, grâce à des sites de reconnaissance et de fixation situés à sa surface. Ce sont des catalyseurs spécifiques puisqu’elles ne peuvent participer qu’à des réactions bien déterminées. A la fin du processus, l’enzyme retrouve sa structure. Il est à noter que les enzymes participent aux réactions ayant lieu dans les organismes vivants. De ce fait, l’enzyme fonctionne dans des conditions douces de température, de pH et de pression.

La réaction catalytique se déroule au niveau du site catalytique dit site actif de l’enzyme, situé dans la poche protéique, cavité aux caractéristiques structurales et chimiques spécifiques. Le site actif de certaines protéines appelé apoenzyme ne peut être efficace que par l’intermédiaire d’un cofacteur. Ce dernier de type métallique (cuivre, zinc, manganèse) ou de type organique (coenzyme) se fixe sur la région catalytique pour favoriser la réaction chimique et aussi contribuer à la stabilité de l’enzyme. La réaction ne peut se dérouler que par la combinaison de l’apoenzyme avec le cofacteur. La substance chimique cible, nommée substrat (S), se fixe sur l’enzyme (E) au niveau du site actif qui permet la réaction. Il se forme alors un complexe intermédiaire ES. Après réaction, le produit (P) est libéré et l’enzyme régénérée. Ce processus s’effectue des milliers de fois à la seconde :

E + S ^k

ES E + P

k

k

k

E + S ES E + P

E + S ^k

ES E + P

k

k

k

Pour déterminer la vitesse de réaction catalytique, on utilise l’équation de Michaelis-Menten qui s’écrit comme suit :

V₀= V_max[S] [S] + K_M V₀= V_max[S] [S] + K_M V_max[S] [S] + K_M

Où V0 est la vitesse initiale de réaction qui détermine l’activité enzymatique, Vmax la vitesse maximale, [S] la concentration du substrat et KM la constante de Michaelis (affinité substrat-enzyme).

L’activité enzymatique peut être réduite ou annulée lors de la dénaturation de l’enzyme (modification structurale, rupture de liaisons) provoquée par la chaleur, par les variations de pH, des concentrations ioniques trop élevées, ou par l’action chimique de solvants organiques. Le site actif peut aussi être modifié et donc devenir inactif provoquant la perte des propriétés catalytiques. Deux types d’inhibition existent. L’inhibition compétitive fait intervenir une molécule imitant le substrat. Il intervient une compétition entre ces deux composés provoquant la diminution, voire la perte de l’activité enzymatique. L’activité catalytique d’une enzyme peut diminuer et même complètement s’arrêter au contact de certaines substances chimiques. L’inhibition non compétitive, quant à elle, engendre une déformation du site actif lors de la fixation de l’inhibiteur sur l’enzyme en un autre point que le site actif.

L’union internationale de Biochimie a élaboré une nomenclature des enzymes pour permettre une meilleure identification. Une enzyme est spécifique à une réaction chimique. La classification des enzymes va donc s’appuyer sur ce point et répertorier les macromolécules de la façon suivante : EC X1.X2.X3.X4. Les nombres de la commission d’enzymes (EC) répartissent six groupes de réactions allant de 1 à 6 (X1). Les réactions catalytiques principales sont les suivantes :

1 : les oxydoréductases. Elles interviennent dans des réactions redox qui mettent en jeu des transferts d’atomes d’hydrogène, d’oxygène ou d’électrons entre les molécules.

2 : les transférases. Elles catalysent le transfert d’un atome ou d’un groupe d’atomes entre deux molécules mais exclut les réactions redox.

3 : les hydrolases. Elles impliquent la coupure de liaisons du substrat avec fixation des radicaux H et OH issus de l’eau.

4 : les lyases. Elles interviennent dans des réactions d’élimination d’un groupe d’atomes du substrat.

5 : les isomérases. Elles favorisent le changement de conformation du substrat.

6 : les ligases. Elles interviennent lors de la formation de liaisons covalentes entre deux molécules, en faisant intervenir l’énergie libérée lors de l’hydrolyse d’un nucléoside triphosphate (ATP).

Les valeurs X2.X3.X4 permettent une meilleure distinction des enzymes en fonction de la nature de la réaction.

Une autre nomenclature intervient dans l’appellation des enzymes. Elle prend en compte le nom du substrat, le type de réaction catalysée et se termine par ase.

Ainsi pour désigner par exemple la glucose oxydase, on utilise les deux appellations de la façon suivante : EC 1.1.3.4 et oxygène 1 oxydoréductase.

Il est important de définir l’implication de l’enzyme lors de la réaction chimique. La quantité d’enzyme présente ou utilisée dans un processus est difficile à déterminer en terme absolu (par exemple : gramme), puisqu’une enzyme possède des proportions variables de matière active et inactive. En effet, la vitesse de réaction est liée à l’activité enzymatique qui se définit comme une unité/masse de protéine. Cette unité libère une micromole de produit par minute dans les conditions optimales en terme de pH, de force ionique et de température.

Pour résumer, l’activité enzymatique est définie par rapport à différents paramètres tels que la température,le pH, le domaine de stabilité de pH, les constantes cinétiques (KM, Vmax).