III Stratégie de confinement de l’uréase
III.2 Comparaison des propriétés structurales et morphologiques des différentes phases [Zn 3-Al-Cl]-Uréase
III.2.1 Etude structurale
III.2.1.1 Diffraction des rayons X sur poudre
Les diffractogrammes des composés obtenus sont représentés sur la Figure 4. La présence des raies de diffraction caractéristiques de la structure HDL sur les diffractogrammes des différentes phases préparées valident l’utilisation des différentes méthodes de synthèse pour la préparation de phases hybrides [HDL]-Uréase. Cependant les résultats cristallographiques montrent des différences importantes.
Figure 4 : Diffactogrammes X a) précurseur [Zn3-Al-Cl], b) phase échangée, c) phase délaminée-reconstruite, c) phase coprécipitée.
Lors de l’échange anionique, l’allure du diffractogramme est peu altérée. Les paramètres de maille affinés sont proches de ceux du précurseurs (Tableau 1 ). Un léger déplacement des raies (00l), indiquant une distance interlamellaire de 0,77 nm, dénote une légère contamination par les carbonates. Seules les intensités diffractées s’effondrent montrant un pourcentage de phase cristallisée plus faible dans la phase traitée par l’enzyme. La biomolécule s’échange à la surface et diffuse entre les particules, force la dispersion quand celle ci est énergétiquement accessible. En effet, les raies de diffraction s’affinent, l’échange anionique est structuralement sélectif, il affecte principalement la fraction du solide la moins bien ordonnée laissant la phase de haute cristallinité non perturbée. Les résultats sont similaires à ceux de l’adsorption. On en déduit donc qu’un précurseur HDL de faible cristallinité devrait favoriser un taux d’échange plus élevé.
Tableau 1 : Paramètres de maille de la phase [Zn3-Al-Cl] précurseur
matrice Groupe d’espace a (nm) c (nm) d (nm)
[Zn3-Al-Cl] R-3m 0,306 2,36 0,787
[Zn3
-Al-Cl]-Uréase ech. R-3m 0,308 2,31 0,777
Contrairement à la phase préparée par échange, les deux autres matrices présentent des modifications structurales significatives.
Pour le procédé de délamination/reconstruction, le diffractogramme montre une contraction de la distance interlamellaire passant de 25,2 Å (caractéristique d’une phase [Zn3-Al-DDS]) à 16,34 Å. Cette phase n’est pas le résultat d’une modification structurale due à l’enzyme. Elle correspond à une phase secondaire souvent mise en évidence au cours de ce procédé de synthèse comme l’ont montré Adachi-Pagano et coll13. Au cours du traitement thermique de la phase HDL [Zn3-Al-DDS] dans le butanol une fraction majoritaire se disperse en solution colloïdale alors que la fraction minoritaire la plus cristallisée subit une contraction de l’espace interlamellaire, favorisée par l’apparition d’un structuration plus compacte des domaines interlamellaires (haut degré d’interdigitation des anions DDS ou orientation des anions intercalés à 57° par rapport à c) et un renforcement des interactions de van der Waals des chaînes alkyle. La perte de cristallinité globale, mise en évidence sur le diffractogramme X, suggère la formation d’un composé amorphe lié à l’association matrice HDL/Uréase.
Le procédé de coprécipitation conduit aux phases hybrides les moins structurées, avec une diminution d’intensité et un élargissement des raies (00l) appréciables (Δθ = 2,12). La préservation des raies (012) et (110) caractéristiques du feuillet HDL est constatée et confirme la formation de la phase HDL malgré l’influence importante de l’uréase sur la structuration de ces composés. En effet, la présence de biomolécules entraîne une forte modification de l’ordre d’empilement des feuillets. Par ailleurs, la position angulaire des raies (00l) suggère la présence de chlorures ou de carbonates dans les domaines interlamellaires. Comme pour les autres procédés de synthèse, l’enzyme n’est pas insérée de manière ordonnée entre les feuillets HDL.
III.2.1.2 Spectroscopie infrarouge
Les spectres infrarouge des différentes matrices obtenues sont représentés sur la Figure 5. Ils coïncident avec la superposition des spectres de l’uréase et de la matrice [Zn3-Al-X]. Ces résultats montrent la formation d’une phase hybride uréase/HDL quel que soit le mode d’association de ces deux partenaires.
Figure 5 : Spectres infrarouges : a) [Zn3-Al-Cl], [Zn3-Al]-Uréase préparée b) par échange anionique, c) par délamination/reconstruction, d) par coprécipitation et e) uréase
Pour toutes les phases préparées, nous observons les bandes de vibrations C=O (amide I) à 1653 cm-1 et de déformation NH (amide II) à 1549 cm-1 de l’enzyme, et les bandes de vibrations du réseaux HDL ( O-M-O à 427 cm-1 et M-O entre 841 et 647 cm-1). Toutefois certains changements sont observés, particulièrement concernant les modes de vibration de l’anion intercalé. La bande à 1360 cm-1 caractéristique des groupements CO32- confirme la carbonatation de la phase HDL/uréase préparée par échange. Dans le cas du procédé de délamination/reconstruction, la bande intense à 1236 cm-1 caractéristique de la liaison O-SO3
-confirme la présence de DDS entre les feuillets. Par contre, pour la phase coprécipitée, aucune bande de vibration d’anions n’est observée suggérant que les anions Cl- issus des sels métalliques viennent compenser la charge positive des feuillets simultanément avec l’uréase.
Les intensités des bandes attribuées à la biomolécule sont plus intenses pour les matériaux hybrides préparés par coprécipitation ou délamination-réempilement suggérant que la quantité d’uréase immobilisée par ces modes de synthèse est plus importante. En effet, pour ces deux procédés, la surface d’échange de la matrice HDL avec l’enzyme est beaucoup plus importante car par coprécipitation le solide se construit à la surface de l’enzyme et par délamination, l’empilement des feuillets exfoliés piège l’enzyme. Dans le cas de l’échange, l’insertion est défavorisée à la fois par la taille trop importante de la biomolécule et par la stabilité des phases HDL chlorures ou carbonates. Le taux d’immobilisation d’uréase a été déterminée par spectroscopie UV-visible (275 nm). La masse d’enzyme immobilisée est calculée par
soustraction de la masse d’enzyme libre en solution à la masse initiale. Pour un rapport initial Q=1, environ 20 % d’uréase est immobilisé par échange pour 100% par coprécipitation. La quantité d’uréase non immobilisée par le procédé délamination-reconstruction n’a pas été mesurée. Il était difficile d’extraire la phase aqueuse de la phase alcoolique. En outre, il est possible qu’une partie de l’uréase ait été transférée dans le solvant alcoolique et soit dénaturée empêchant la détermination de sa concentration par spectroscopie UV.
III.2.2 Etude morphologique par microscopie électronique à balayage
Les différents clichés de microscopie électronique à balayage de la matrice de référence [Zn3 -Al-Cl] coprécipitée et des différentes phases hybrides sont représentés sur la Figure 7
En général, les phases [Zn3-Al-Cl] coprécipitées présentent une morphologie homogène constituée de particules primaires de forme pseudo-hexagonale agrégées en « rose des sables » où les plaquettes individuelles de tailles comprises entre 500 et 800 nm sont relativement bien identifiées.
Les clichés MEB réalisés sur les matériaux hybrides affichent certaines modifications texturales.
La phase préparée par échange présente un aspect morphologique peu différent du précurseur mais une apparence plus fondue. L’adsorption de l’uréase sur la surface externe des particules secondaires conduit à la désagrégation des petites cristallites de surface et à une réorientation des plaquettes modifiées par l’uréase.
La méthode de délamination affecte l’agrégation des plaquettes en particules secondaires. On perd l’association en rose des sables au profit d’une agrégation en plaquettes empilées. Les particules primaires ne sont plus identifiées. La présence de molécules organiques (dodécylsulfate et enzyme) modifie la rigidité des plaquettes, leur confère une meilleure flexibilité et entraîne un repliement des bords.
Figure 6 : Clichés MEB a) précurseur, b) phase échangée, c) phase délaminée/reconstruite, d) phase coprécipitée
Les clichés obtenus pour la phase hybride coprécipitée sont focalisés sur la face et sur la tranche d’un agrégat. Ces images révèlent une très forte orientation préférentielle des cristallites. Le cliché de la tranche de la particule montre clairement l’agencement des plaquettes empilées toutes parallèles. L’observation de la face de l’agrégat montre quant à elle un arrangement de particules ondulées en château de cartes. Les plaquettes s’accolent par leurs
côtés latéraux, délimitant une porosité élevée. Les épaisseurs des particules sont comprises entre 50 nm et 100 nm.
La présence des biomolécules dans le milieu de synthèse joue un rôle texturant directeur lors de la précipitation des hydroxydes doubles lamellaires puisque la phase obtenue perd son aspect textural bien défini et homogène au profit d’une agrégation dense des plaquettes orientées.
L’analyse des éléments par la technique EDX a été réalisée sur les échantillons lors des analyses microscopiques (Figure 9).
Figure 7 : Clichés MEB avec couplage EDX pour les phases hybrides préparées par a) échange, b) délamination/reconstruction, c) coprécipitation
Pour toutes les phases, les éléments constitutifs du feuillet (zinc, aluminium et oxygène) sont identifiés. Ces analyses qualitatives nous apportent des renseignements utiles.
Les rapports des pics Zn/Al sont pratiquement les mêmes pour les 3 échantillons, ce qui confirme le maintien ou la formation de phases mixtes [Zn-Al]. Les résultats d’analyse confirment la présence d’anions Cl- pour les phases échangées, de soufre provenant des anions
DDS pour les phases délaminées, d’anions Cl- pour les phases coprécipitées ainsi qu’un taux de carbone élevé en fonction du taux d’immobilisation d’uréase. Le confinement de l’uréase dans les phases HDL ne permet jamais de contrebalancer toutes les charges positives des feuillets, la co-intercalation d’anions est donc nécessaire ; la répartition des espèces anioniques en surface ou entre les feuillets dépend de leur taille.