Généralisation du modèle : cas du récepteur 5-HT 1B

Un exemple que je souhaiterais développer concerne les récepteurs de la sérotonine 5-HT1A et 5-HT1B. En effet, ces récepteurs possèdent une combinaison de caractéristiques pharmacologiques et de localisation cellulaire intéressante du point de vue du modèle de cycle constitutif polarisant et de l’adressage des RCPG axonaux. Notre équipe a donc démarré une collaboration avec Michèle Darmon et son équipe à l’UMR 677 du Pr Michel Hamon. Les récepteurs 5-HT1A et 5-HT1B sont principalement exprimés dans les neurones sérotoninergiques des noyaux du raphe dorsaux et médians (autorécepteurs), et dans les territoires de projection des neurones sérotoninergiques, dans les aires limbiques et dans certaines aires corticales (hétérorécepteurs) (Barnes and Sharp, 1999). Concernant 5-HT1B, la localisation différentielle de l’ARNm et de la protéine avait suggéré une localisation axonale (Boschert et al., 1994), ce qui a été confirmé par microscopie électronique (Riad et al., 2000) et par expression dans les neurones en culture (Ghavami et al., 1999). Le récepteur 5-HT1B est exprimé à la surface des axones, mais au niveau préterminal plutôt que présynaptique, tout comme CB1 (Riad et al., 2000). Par contraste, 5-HT1A est un récepteur localisé exclusivement sur la membrane somatodendritique in vivo (Miquel et al., 1991; Riad et al., 2000) et in vitro (Ghavami et al., 1999).

L’analogie entre la polarisation neuronale et épithéliale a été exploitée par Michèle Darmon et ses collaborateurs, qui ont exprimé 5-HT1A et 5-HT1B dans les cellules épithéliales LLC-PK1 (Langlois et al., 1996). Les récepteurs 5-HT1A sont exprimé à la membrane basolatérale, ce qui est cohérent avec leur localisation somatodendritique dans les neurones, tandis que les récepteurs

5-Figure 27 : Distribution subcellulaire des récepteurs 5-HT1Aet 5-HT1B

A/ Dans les cellules épithéliales LLC-PK1, le récepteur 5-HT1A est exprimé à la membrane basolatérale

(à gauche), tandis que le récepteur 5-HT1B est présent dans des vésicules intracellulaires, ainsi qu’à la

membrane apicale (à droite). D’après Darmon et al., 1998.

B/ Dans les neurones d’hippocampe en culture, le récepteur 5-HT1A (en haut, en rouge) est localisé à

la membrane somatodendritique, compartiment où est exprimé MAP2 (en vert). Le récepteur 5-HT1B

(en bas, en rouge) est exprimé le long de l’axone, comme le montre le marquage avec les neurofilaments de 200 kD (en vert), mais également présent dans le compartiment somatodendritique, avec un marquage qui apparaît intracellulaire. D’après Jolimay et al., 2000.

HT1B sont majoritairement intracellulaires, avec une population de surface plutôt apicale, à mettre en regard de leur distribution axonale coexistant avec un marquage somatodendritique vésiculaire dans les neurones en culture (Ghavami et al., 1999; Jolimay et al., 2000)(Figure 27). D’élégantes expériences de domain swapping menées par l’équipe de Michèle Darmon à l’UMR 677 (Hôpital de la Pitié-Salpêtrière) ont montré que les domaines responsables de cette différence de polarisation entre les deux récepteurs sérotoninergiques sont localisés dans la troisième boucle intracellulaire et dans la queue carboxyterminale (Darmon et al., 1998; Jolimay et al., 2000).

Parallèlement à ces études de la distribution des récepteurs 5-HT1A et 5-HT1B, les études pharmacologiques ont détaillé le couplage et la signalisation associés à ces récepteurs, dont la pharmacologie est assez proche de celle du récepteur CB1. Les deux récepteurs 5-HT1A et 5-HT1B sont couplés aux protéines Gi/o, provoquent l’inhibition de l’adénylate cyclase de type II, inhibent l’activité des canaux calciques et potentialisent les canaux potassiques (Albert and Tiberi, 2001). Les récepteurs 5-HT1A et 5-HT1B sont susceptibles de présenter une activité constitutive (Albert et

Figure 28 : Activité constitutive des récepteurs 5-HT1Aet 5-HT1B

Les récepteurs sont transfectés de manière stable dans les

cellules LLC-PK1, et l’activité est testée par 35[S]-GTPγS sur des

préparations de membranes. En ordonnées sont rapportées les valeurs brutes de radioactivité des différentes préparations. La

présence du récepteur 5-HT1A ne modifie pas l’activité basale

(au centre, en bleu), mais l’agoniste 5-CT stimule le récepteur et augmente le couplage (au centre, en rouge). L’antagoniste méthiotépine ne change pas la valeur d’activité basale (au

centre, en vert). L’activité basale du récepteur 5-HT1B est

importante (à droite, en bleu), et le récepteur peut encore être activé par la 5-CT (à droite, en rouge). Le SB224289 est agoniste inverse, ramenant le couplage du récepteur aux niveaux de base observés pour les cellules non transfectées ou

transfectées avec 5-HT1A (à droite, en vert).

al., 1999; Seifert and Wenzel-Seifert, 2002), dans des modèles d’expression hétérologues comme les cellules CHO (Newman-Tancredi et al., 2000; Cosi and Koek, 2001) ou HEK-293 (Albert et al., 1999). Dans les cellules épithéliales LLC-PK1, le récepteur 5-HT1A présente une activité constitutive limitée, tandis que le récepteur 5-HT1B possède une activité constitutive importante, capable d’être inhibée par l’agoniste inverse SB224289 (données communiquées par Damien Carrel, Figure 28). Il semblerait donc qu’une différence existe dans l’activité constitutive des deux récepteurs, le récepteur 5-HT1B axonal présentant une activité constitutive significative.

Marc Biard, au sein de notre équipe, a utilisé la méthode SCOP pour étudier le trafic intracellulaire des récepteurs 5-HT1A et 5-HT1B. Les fusions 5-HT1A-eGFP et 5-HT1B-eGFP, exprimées dans les cellules HEK-293, présentent une distribution très différente : 5-HT1A-eGFP est exprimé à la membrane plasmique, tandis que 5-HT1B-eGFP présente une distribution vésiculaire intracellulaire, similaire à celle observée dans les cellules LLC-PK1 (Langlois et al., 1996) (Figure

29A). La quantification en terme de rapport récepteur de surface (S)/récepteur cytoplasmique (C) a

été effectué, et le ratio S/C de 5-HT1B est similaire à celui de CB1 (autour de 0,2). Le récepteur peut être internalisé par l’agoniste sumatriptan, et externalisé par l’agoniste inverse SB22489, suggérant la présence d’un cycle constitutif. Cette externalisation peut être inhibée par la monensine, montrant l’implication du recyclage dans l’effet de l’agoniste inverse (Figure 29B). L’inhibition de l’endocytose par la méthyl-β-cyclodextrine (MβCD) externalise également le récepteur, tandis que l’incubation avec la monensine seule a tendance à accumuler les récepteurs dans les compartiments intracellulaires (Figure 29C). L’ensemble de ces résultats montre que le récepteur 5-HT1B constitutivement actif est engagé dans un cycle d’endocytose/recyclage similaire à celui de CB1, tandis que le récepteur 5-HT1A, sans doute dépourvu d’activité constitutive, est exprimé à la membrane plasmique.

La réunion de l’ensemble de ces résultats se résume ainsi : le récepteur 5-HT1B est constitutivement actif dans les lignées cellulaires, et présente un cycle constitutif d’endocytose/recyclage dans les cellules HEK-293. Dans les neurones, le récepteur est exprimé dans des vésicules somatodendritiques et à la surface de l’axone. Examiné sous l’angle du cycle constitutif polarisant découvert pour le récepteur CB1, on peut avancer que le récepteur 5-HT1B est exprimé à la surface des axones grâce au même mécanisme. Le récepteur 5-HT1A possède quant à lui une activité constitutive plus limitée, est stable à la membrane dans les cellules HEK-293 et présente une distribution somatodendritique membranaire dans les neurones : ce récepteur proche de 5HT1B mais possédant une activité constitutive plus faible renforce la démonstration du rôle de l’activité constitutive dans l’adressage axonal des RCPG.

Figure 29 : Cycle constitutif

d’endocytose/recyclage de 5-HT1B dans les cellules HEK-293

Les cellules HEK-293 sont transfectées de

manière transitoire avec 5-HT1A-eGFP et

5-HT1B-eGFP, et la distribution des

récepteurs est visualisée et quantifiée selon la méthode SCOP (Leterrier et al., 2004).

A/ Distributions de 5-HT1A et 5-HT1B en

absence de ligand. 5-HT1A est exprimé à la

membrane plasmique, tandis que 5-HT1B

est majoritairement intracellulaire, ce qui se traduit par un ratio S/C plus faible. B/ Effet des ligands sur la distribution de 5-HT1B. Les traitements sont appliqués pendant 3h. L’agoniste sumatriptan à 1 μM provoque une internalisation de 5-HT1B (diminution du S/C), tandis que l’agoniste inverse SB224289 à 1 μM externalise les récepteurs (augmentation du S/C). Cette externalisation est inhibée par l’inhibiteur du recyclage monensine (70 nM).

C/ Effet de l’inhibition du recyclage et de

l’endocytose sur la distribution de 5-HT1B.

La monensine à 70 nM pendant 3h

accumule le récepteur 5-HT1B dans les

endosomes (diminution du S/C), tandis que le traitement par la méthyl-β-cylcodextrine (MβCD) pendant 1h externalise les récepteurs (augmentation du S/C). La coapplication des deux traitements ne change pas l’équilibre entre les récepteurs membranaires et intracellulaires.

C