1 Trafic intracellulaire du récepteur CB1
1.4 Discussion
1.4.3 Cycle de trafic d’un RCPG constitutivement actif
Nos résultats constituent la première étude précise du trafic intracellulaire consécutif à l’activité constitutive d’un RCPG sauvage. La modulation de la population membranaire des récepteurs CB1 après traitement par un agoniste ou un agoniste inverse avait été observée par Rinaldi-Carmona et ses collaborateurs (Rinaldi-Carmona et al., 1998) qui l’avaient interprétée dans
Figure 21 : Visualisation directe du cycle endocytique
La mise au point du rinçage acide (acid strip) permet le marquage différentiel de différente populations de récepteurs.
En haut est représentée la méthode de triple marquage (en haut) permettant de visualiser simultanément les récepteurs CB1 totaux (en vert), internalisés pendant une heure (en bleu), et présents à la surface (en rouge).
En bas, la méthode de feeding/acid strip successifs permettant de visualiser les récepteurs totaux (en vert) et les récepteurs ayant réalisé un cycle et demi (endocytose/recyclage/endocytose, en rouge).
un cadre pharmacologique, le trafic cellulaire sous-jacent restant hypothétique. Nous avons caractérisé et détaillé ce trafic, montrant que l’agoniste inverse produit une externalisation par un mécanisme préalablement décrit pour des récepteurs mutants constitutivement actifs du récepteur AT1A (Miserey-Lenkei et al., 2002). De plus, nous avons montré que le trafic intracellulaire du récepteur après son activation dépend de Rab5 et Rab4, mais pas de Rab11, et cela constitue la première description moléculaire d’un RCPG engagé dans cycle d’endocytose/recyclage constitutif. En effet, les études du trafic intracellulaire des RCPG étaient jusqu’alors restreintes aux événements suivant l’activation par un agoniste du récepteur, sans prendre en compte la possibilité d’une activité constitutive (Rosenfeld et al., 2002).
Ce travail s’inscrit néanmoins dans une progression constante des connaissances sur le trafic intracellulaire des RCPG. Partant de la connaissance du mécanisme d’endocytose des RCPG suite à leur activation par des agonistes, l’endocytose spontanée en absence de ligand a été caractérisée pour plusieurs récepteurs, en utilisant les techniques de biochimie classiques (binding et biotinylation de surface) et l’examen de la localisation subcellulaire. Ces études ont démontré l’endocytose spontanée du récepteur activé par la thrombine PAR1 (Shapiro et al., 1996), du récepteur à la cholecystokinine CCKA (Tarasova et al., 1997), des récepteurs aux chemokines CCR5 et CXCR4 (corécepteurs utilisés par le virus du VIH pour l’entrée dans la cellule) (Signoret et al., 1997; Signoret et al., 2000), des récepteurs à la vasopressine V2a et V1a (Innamorati et al., 2001), des récepteurs métabotropiques au glutamate mGluR1a (Dale et al., 2001) et mGlur5 (Fourgeaud et al., 2003). Ces études n’abordaient toutefois pas la possibilité d’un recyclage constitutif du récepteur, donc d’un cycle permanent entre la membrane plasmique et les endosomes.
Un cas particulier de cycle constitutif d’endocytose et de recyclage pour un R7TM concerne les récepteurs viraux, qui sont proches des récepteurs chemokine et dont l’expression est induite par les virus suite à l’infection de la cellule. Ces récepteurs n’ont pas à proprement parler de ligand, sont constitutivement actifs, et activent des voies de signalisation favorisant la synthèse et la multiplication du virus (Rosenkilde, 2005). Ils sont spontanément internalisés et recyclés, comme cela a été démontré pour US28 codé par le cytomégalovirus humain (Fraile-Ramos et al., 2001). Par ailleurs, des exemples de RCPG mammifères possédant un cycle constitutif (endocytose + recyclage) ont été rapportés dans la littérature : les études suivant la démonstration de l’endocytose constitutive de PAR1 ont démontré son recyclage constitutif (Shapiro and Coughlin, 1998). Le récepteur au thromboxane A2 TPβ possède un cycle constitutif d’endocytose et de recyclage (Parent et al., 2001), et ce cycle dépend de Rab11 (Theriault et al., 2004). Le récepteur à la calcitonine CTR cycle constitutivement et son recyclage est dépendant de la filamine (Seck et al., 2003). Le récepteur muscarinique M2 (Roseberry and Hosey, 1999), le récepteur à la thyrotropine
TSHR (Baratti-Elbaz et al., 1999), et le récepteur à la galanine GR2 (Xia et al., 2004) sont tous susceptibles d’être constitutivement internalisés et recyclés, mais ce phénomène est présenté comme un mécanisme lent et minoritaire, conservant la plus grande partie des récepteurs à la membrane plasmique.
Cependant ces travaux, qui s’inscrivent dans des problématiques de biologie cellulaire, abordent rarement le lien entre la présence d’un cycle constitutif d’endocytose/recyclage et l’activité constitutive du récepteur. C’est l’originalité de notre travail qui démontre le lien fort existant entre l’état d’activation du récepteur et son trafic intracellulaire. Ceci est basé sur la modulation du cycle endocytique par les agonistes inverses qui inhibent l’activité constitutive du récepteur. Deux autres études menées parallèlement à nos travaux ont simultanément démontré la présence d’un cycle constitutif d’endocytose/recyclage de RCPG constitutivement actifs. Le récepteur métabotropique au glutamate mGluR1a possède une activité constitutive importante (Prezeau et al., 1996), qui peut être inhibée par les agonistes inverses LY367385 et BAY36-7620 (Pula et al., 2004) (Figure 22A). Le récepteur mGluR1b est un variant d’épissage alternatif qui possède une queue carboxyterminale plus courte et ne présente pas d’activité constitutive. Exprimé dans les cellules HEK-293, mGluR1a est majoritairement intracellulaire et mGluR1b est localisé surtout à la membrane plasmique. L’activité constitutive de mGluR1a provoque son endocytose constitutive, et les agonistes inverses externalisent mGluR1a à la membrane plasmique avec un effet maximal à 1h (Pula et al., 2004) (Figure 22A). Ceci constitue un second exemple de récepteur dont l’activité provoque un cycle d’endocytose/recyclage modulable par les agonistes inverses. Le deuxième autre exemple d’un tel comportement est représenté par le récepteur à la sérotonine 5-HT2C (Marion et al., 2004). Ce récepteur existe sous de multiples formes dépendantes d’une édition de l’ARN qui provoque une mutation des acides aminés aux positions 156, 158 et 160. Le récepteur non édité (INI) est constitutivement actif à 100 %, tandis que le récepteur semi-édité (VSV) est constitutivement actif à 50 % et que le récepteur totalement édité (VGV) présente une activité constitutive négligeable (Niswender et al., 1999; Berg et al., 2001) (Figure 22B). Cette gradation des activités constitutives est corrélée avec leur localisation subcellulaire, le récepteur INI étant majoritairement intracellulaire alors que le VSV et le VGV sont plus membranaires. L’équipe de Marc Caron a démontré que l’activité constitutive du récepteur était responsable de la phosphorylation des récepteurs par GRK2, du recrutement constitutif des β-arrestines et de l’internalisation constitutive des récepteurs. L’agoniste inverse SB206553 est capable d’externaliser les récepteurs dans le cas des variants constitutivement actifs (Marion et al., 2004) (Figure 22B).
Figure 22 : Cycles endocytiques de RCPG constitutivement actifs
A/ Récepteur métabotropique au glutamate mGluR1A. L’activation constitutive du récepteur provoque une
accumulation d’IP3 dans les cellules HEK-293 transfectées, augmentation inhibée par les agonistes inverse
BAY36-720 et LY397385 mais pas par l’antagoniste neutre CPCCOEt (à gauche). Le récepteur est constitutivement internalisé en l’absence de ligand (panel de gauche, en haut), et ceci est bloqué par l’agoniste inverse LY367385 (panel de gauche, en bas). L’isoforme mGluR1b, qui n’est pas constitutivement actif, n’est pas internalisé en absence de ligand (panel de droite, en haut), mais s’internalise après traitement par le glutamate (panel de droite, en bas). D’après Pula et al., 2004.
B/ Récepteur à la sérotonine 5-HT2C. Le récepteur présente une édition post-transcriptionnelle, pouvant
exister sous forme non éditée (INI) et sous forme totalement éditée (VGV). La forme INI est constitutivement
active, stimulant la production d’IP3 dans les cellules HEK-293, tandis que la forme VGV ne possède pas
d’activité constitutive (à gauche). Le récepteur 5-HT2C-INI est majoritairement intracellulaire (panel de
gauche, en haut) et est externalisé par l’agoniste inverse (panel de gauche, en bas), contrairement au 5-HT2C
-VGV qui est membranaire en condition contrôle et s’internalise sous l’effet de la sérotonine (panel de droite). D’après Marion et al., 2004.
Quel est la pertinence de ces résultats ? Concernant le cycle constitutif d’endocytose et de recyclage, le grand nombre de récepteurs possédant cette caractéristique montre que la cellule utilise abondamment ce mécanisme pour réguler le nombre de récepteurs présents à la membrane plasmique (Royle and Murrell-Lagnado, 2003). Concernant le lien entre ce cycle constitutif et l’activité constitutive du récepteur, nos travaux ainsi que ceux de Marion et al (Marion et al., 2004) indiquent que les deux événements sont liés et qu’une corrélation existe entre l’importance de l’activité constitutive et la proportion de récepteurs présents dans les différentes étapes du cycle. Cependant, d’autres travaux indiquent un lien moins marqué entre l’activité constitutive et le cycle d’endocytose/recyclage. Le récepteur α1A adrénergique possède une activité constitutive et cycle constitutivement dans les cellules fibroblastes Rat-1. L’incubation des cellules avec un agoniste inverse, la prazosine, est capable d’externaliser seulement une minorité des récepteurs α1AAR, entraînant une augmentation de la population membranaire d’environ 20 % (Morris et al., 2004). Peut-être s’agit-il d’un comportement agoniste inverse partiel de la prasozine dans ce système. Il est intéressant de noter que la prazosine est capable d’externaliser un autre sous-type constitutivement actif du récepteur α1 adrénergique, α1DAR (McCune et al., 2000). Plus troublant, le récepteur métabotropique au glutamate mGluR5 est endocyté constitutivement dans les cellules COS et les neurones d’hippocampe en culture (Fourgeaud et al., 2003). Cette endocytose ne dépend pas de l’état d’activation du récepteur, car elle n’est modifiée ni par la présence de l’agoniste inverse MPEP, ni par l’introduction de mutations rendant le récepteur insensible au glutamate. Si ces résultats sont confirmés par d’autres études, cela signifierait que l’activité constitutive d’un récepteur n’est pas toujours nécessaire à son endocytose constitutive. Néanmoins, l’effet des agonistes inverses d’inhibition de l’endocytose constitutive a été largement corroboré par des études sur de nombreux récepteurs, mutants ou sauvages. Ceci inclut l’uprégulation de récepteurs constitutivement actifs après traitement à long terme par l’agoniste inverse (Milligan and Bond, 1997) ainsi que les observations d’externalisation après traitement à court terme (Parnot et al., 2002).