La fraction de marquage de l’actine perturbe l’action de la formine

de la formine

Les diverses expériences de ce projet ont été faites avec diverses fractions de marquage (nul ou avec un taux de 15 %, avec l’Alexa 488). L’expérience utilisant un marquage nul utilise les filaments rayés (voir méthodes). La présence des monomères marqués réduit la vitesse d’élongation (voir figure 1 de l’article), en cohérence avec l’étude de Kuhn et collaborateur [237]. Nous avons alors supposé que le taux pourrait être un paramètre

6.2 Résultats 167

modulant la processivité. Une étude spécifique a été effectuée en configuration bout barbé libre, aux concentrations d’actine (1µM) et de profiline (5 µM) fixées, mais également avec une plus large gamme de taux de marquage (variant de 5% à 37%). Cela nous montre que la présence de fluorophores sur l’actine réduit fortement la processivité de la formine (voir figure 1 de l’article).

6.2.4

Effet de la vitesse d’élongation

L’effet de la concentration d’actine sur la processivité

L’article de Paul & Pollard mesure l’effet du taux d’élongation des filaments sur la disso- ciation de la formine Bni1p, à une concentration de 50 mM KCl. J’ai fait les expériences en configuration bout barbé libre, à une concentration de 100 mM KCl. J’ai observé, sur plu- sieurs expériences, le temps de présence des formines allongeant des bouts barbés libres à diverses concentrations d’actine (actine marquée à 15 %), mais également de profiline. J’ai tout d’abord tracé l’effet du taux d’élongation sur la dissociation, indépendamment de la concentration en actine ou en profiline.

FIGURE6.3 L’actine réduit la processivité de la formine. En configuration bout barbé

libre, la formine (FH1-FH2-DAD-His) assemble des filaments à des concentrations fixées de profiline (0, 5 ou 20µM), puis à 1, 2 ou 3 µM d’actine. Cela mène à diverses vitesses d’élongation. Les taux de détachement (sec−1) correspondant à ces vitesses d’élongation (su.sec−1) sont montrés sur la figure A, tandis que ceux correspondant aux concentra- tions d’actine sont montrés sur la figure B. Erreurs taux de dissociation : les données représentées dans les deux graphiques sont issues des mêmes expériences.

L’effet monotone, montré par l’étude sur Bni1p, n’est ici valable que si on reste à une concentration de profiline donnée. Il ne semble pas y avoir de corrélation directe entre le taux d’élongation et la dissociation (voir figure 6.3.A).

Ce qui est important au vu de ces données, c’est la façon dont varie le taux d’élongation. En effet, on peut modifier l’élongation de la formine, soit avec la concentration d’actine, soit de profiline, cette dernière ayant un effet biphasique. En traçant l’évolution du taux de dissociation en fonction de la concentration en actine (voir figure 6.3.B), pour plusieurs concentrations en profiline (sans profiline, 5 et 20µM), on peut montrer que pour chaque concentration de profiline fixée, l’augmentation monotone est bien visible. On peut alors déduire que, à profiline fixée, la concentration en actine réduit la processivité.

Article En se basant sur une expérience à filaments rayés, l’influence de la concentration d’actine sur la dissociation de la formine en absence de profiline a pu être déterminée. Dans ce cas, le taux de dissociation de la formine augmente également avec la concentra- tion d’actine (voir figure 2 de l’article et figure 6.3).

L’observation selon laquelle la dissociation de la formine est croissante avec la concen- tration d’actine, à tout autre paramètre fixé, est cohérente avec l’étude de Paul & Pol- lard [205]. Nous devons cependant étudier plus en détails la contribution de la profiline dans la processivité.

L’effet de la profiline sur la processivité

Pour se rendre compte de l’effet de la profiline, on trace directement le taux de disso- ciation en fonction de la concentration en profiline. On constate alors une décroissance monotone du taux de dissociation avec la concentration en profiline (voir figure 6.4.A). L’effet de la profiline sur les vitesses d’élongation est biphasique (voir figure 6.4.B), confir- mant bien des études ayant observé ce phénomène, rappelés dans le chapitre 3 [218].

Dans une gamme de faibles concentrations de profiline, tandis que l’élongation aug- mente, le taux de dissociation diminue. Ceci confirme que la profiline n’abaisse pas la processivité en abaissant le taux d’élongation, mais bien par un effet propre.

De plus, des expériences de détachement de formine (FH1-FH2-DAD-His) au cours du temps ont été faites en absence de profiline, en se basant sur l’expérience à filaments rayés. Il semble que le taux de détachement, obtenu à concentration de profiline nulle, soit proche de celui obtenu avec une concentration de 1µM de profiline (voir figure 6.4.A). La précision de l’expérience ne nous permet pas de savoir si le détachement augmente ou décroit légèrement entre ces deux conditions (voir figure 2 de l’article).

6.2 Résultats 169

FIGURE 6.4 La profiline augmente la processivité de la formine, indépendamment

de son effet sur la vitesse d’élongation du bout barbé. A : En configuration bout

barbé libre, sont étudiées les formines possédant 14 (FH1-FH2-DAD-His, notée P14), 6 (FH16pol y−pr ol i nes-FH2-DAD-His, notée P6), ou 2 segments poly-prolines (FH12pol y−pr ol i nes-FH2-DAD-His, notée P2). Elles assemblent des filaments à une concen- tration d’actine fixée à 1 µM et marquée à 15 % ou sans marquage (pour la formine (FH1-FH2-DAD-His), voir légende), et à diverses concentrations de profiline, notées ici en abscisse. Les taux de détachement correspondants sont notés en ordonnée. Erreurs taux de dissociation : erreurs estimées par simulation et de plus nous prenons, le cas échéant, les artefacts d’ancrage en compte. B : Sont représentées les évolutions des vitesses d’élon- gation correspondant aux mêmes conditions que celles de la figure A, pour des bouts barbés allongés avec les 3 constructions de formines différentes (voir légende). Erreurs vitesses d’élongation : écart-types des vitesses calculées pour toute la population de bouts barbés pendant l’expérience.

La profiline et le domaine FH1 Ainsi, la profiline augmente nettement la processivité.

Nous avons voulu savoir plus spécifiquement son rôle dans la processivité, puisque la profiline peut potentiellement intervenir via une interaction directe avec les sous-unités du bout barbé, sans interagir avec le domaine FH1, ou bien via son interaction avec le domaine FH1.

L’action de la profiline sur la processivité via son interaction avec le domaine FH1 pourrait être due à la formation du "ring complex". En effet pendant sa formation, en plus du domaine FH2, le domaine FH1 interagit avec le bout barbé par l’intermédiaire de la profiline. La formine est d’autant plus liée au filament, potentiellement plus processive. Stériquement, le domaine FH1 pourrait empêcher ou limiter la dissociation du domaine FH2. Il pourrait également, en cas de rupture des liaisons entre FH2 et le bout barbé, perturber la diffusion du domaine FH2 et lui permettre de se lier à nouveau au bout barbé.

Aussi, la probabilité que le "ring complex" se forme augmente avec la concentration en profiline, comme nous l’avons vu en chapitre 3. Cela expliquerait donc pourquoi la formine est d’autant plus liée au bout barbé en présence d’une forte concentration de profiline.

Les troncations du domaine FH1 inhibant faiblement ses fonctions Pour tester cette

hypothèse, une possibilité est de tronquer le domaine FH1 de mDia1. Cela pourra po- tentiellement réduire la probabilité de formation de "ring complex", puisque moins de segments poly-prolines "n’amènent" pas autant de complexes d’actine-profiline au bout barbé [224]. La formine y serait alors moins liée au cours du temps et la processivité serait réduite par rapport à la construction normale de mDia1, contenant 14 segments poly-prolines sur un des hémidimères du domaine FH1.

Luyan Cao a alors créé deux nouvelles constructions de formine, contenant : — 2 segments poly-prolines (FH12pol y−pr ol i nes -FH2-DAD-His)

— 6 segments poly-prolines (FH16pol y−pr ol i nes -FH2-DAD-His)

J’ai ensuite étudié la processivité de ces deux constructions de formines, en configura- tion bout barbé libre.

A concentration d’actine fixée à 1µM et à 100 mM KCl, on constate, pour les deux constructions, une décroissance monotone du taux de dissociation en fonction de la concentration en profiline (voir figure 6.4.A). De plus, à chaque concentration de profiline, la construction ayant un très court domaine FH1 (FH12pol y−pr ol i nes-FH2-DAD-His) se dis- socie plus rapidement que les deux autres, qui contiennent 6 et 14 segments poly-prolines sur leurs hémidimères FH1. Dans chacune de ces conditions, les vitesses d’élongation en présence de la formine (FH12pol y−pr ol i nes -FH2-DAD-His), sont inférieures à celles obtenues avec les deux autres constructions. Les différences entres les constructions contenant 14 ou 6 segments poly-prolines ne semblent pas significatives tant au niveau de leurs taux de dissociation que de leurs vitesses d’élongation (voir figure 6.4).

En résumé, seule la formine au domaine FH1 fortement tronqué (FH12pol y−pr ol i nes -FH2-DAD-His) voit à la fois sa processivité et sa vitesse d’élongation diminuées par rapport à la construction initiale (FH1-FH2-DAD-His). En présence de profiline, il semble qu’une probabilité d’interaction entre le complexe d’actine-profiline et le bout barbé, via le domaine FH1, est plus importante avec un grand nombre de segments poly-prolines. Cela confirme ce qu’avait également observé Courtemanche et collaborateurs, regardant de troncations des domaine FH1 sur l’activité de Bni1p [224].

6.2 Résultats 171

Article : la profiline n’a pas d’effet sur la processivité sans le domaine FH1 Dans le

but d’étudier le rôle de la profiline et du domaine FH1, une autre construction à été créée, purifiée puis étudiée par Luyan Cao. Il s’agit de la construction de formine mDia1 ne possédant pas le domaine FH1, soit seulement un domaine FH2 fonctionnel (FH2- DAD-His). Cette construction, comme des constructions similaires mentionnées dans le chapitre 3, suffit à nucléer et suivre processivement le bout barbé d’un filament d’actine, ce qui a été vérifié pendant nos expériences (voir figure 3 de l’article). N’ayant pas non plus réussi à marquer cette formine de manière à la suivre plus simplement, elle est étudiée en configuration formine ancrée, ancrage qui se fait via son étiquette His. Du fait de cet ancrage, la formine ne peut être étudiée à force purement nulle, comme c’est le cas pour une configuration en bout barbé libre. Nous estimons tout de même qu’avec un faible écoulement la force exercée sur le domaine est négligeable, d’une valeur d’environ 0.1-0.2 pN. Nous nucléons initialement le filament avec de l’actine marquée, mais le reste de l’étude du détachement des filaments de la formine (FH2-DAD-His) se fait avec de l’actine non marquée.

C’est dans ces conditions que la processivité de cette formine (FH2-DAD-His) est étudiée. À concentration d’actine fixée à 1µM, la formine (FH2-DAD-His) est étudiée à plusieurs concentrations de profiline (0, 5 et 10µM, voir figure 6.5). La profiline abaisse de façon monotone la vitesse d’élongation du bout barbé (voir figure 3 de l’article). De plus, on observe que le taux de dissociation augmente linéairement avec la vitesse d’élongation, et ce de la même manière et indiscernablement pour les 3 concentrations de profiline (voir figure 6.5). Dans le cas où le domaine FH1 est absent, il est attendu qu’un excès de profiline entre en compétition directement pour le bout barbé, ce qui résulte en une diminution de la vitesse d’élongation même à faible concentration de profiline.

On a ensuite comparé ces expériences avec celles faites à base de filaments rayés, utilisant la construction de formine mDia1 (FH1-FH2-DAD-His), de l’actine non marquée et sans profiline. Ces études ont été faites à trois concentrations d’actine différentes (0.3, 0.6 et 1µM). Ces 3 concentrations allongent le bout barbé à des taux d’élongation de la même gamme que les taux d’élongation correspondant aux expériences précédentes faites avec la formine (FH2-DAD-His). Comme le montre la figure 6.5, le taux de dissociation augmente avec le taux d’élongation et de façon similaire au cas de la formine (FH2-DAD- His).

Les données du détachement en fonction du taux d’élongation sont indiscernables pour chacune des 3 expériences décrites ci-dessus :

— Formine (FH2-DAD-His), sans profiline — Formine (FH2-DAD-His), avec profiline

FIGURE6.5 L’interaction FH1-profiline est nécessaire pour une régulation de la proces-

sivité par la profiline. En configuration ancrée, les formines (FH2-DAD-His) assemblent

à force négligeable, des filaments à 1µM d’actine, avec 0, 5 ou 10 µM de profiline. Leurs taux de détachements et les vitesses d’élongation sont mesurés. Les taux de détachement (sec−1) correspondant à ces vitesses d’élongation (su.sec−1) sont indiqués par les points représentant chacun une expérience différente. Avec d’autres expériences, à filaments rayés, des filaments sont assemblés par les formines (FH1-FH2-DAD-His), en absence de profiline ("0µM (FH1 FH2)" dans la légende). Les taux de détachement (sec−1) corres- pondant à ces vitesses d’élongation (su.sec−1) sont indiqués par les points noirs. Erreurs vitesses d’élongation : écart-type des vitesses calculées pour toute la population de bouts barbés pendant l’expérience. Erreurs taux de dissociation : erreurs estimées par simula- tion. Les artefacts liés à l’ancrage de la formine (FH2-DAD-His) sont pris en compte par une expérience de renucléation, telle que décrite au chapitre 4.

— Formine (FH1-FH2-DAD-His), sans profiline

Sans le domaine FH1, l’absence ou présence de profiline ne change pas l’influence du taux d’élongation sur son détachement. La profiline seule ne joue pas de rôle dans la processivité. Sans profiline, l’absence ou présence du domaine FH1 ne change pas l’influence du taux d’élongation sur son détachement, ce qui confirme que le domaine FH1 seul ne joue pas de rôle dans la processivité. En conclusion, la profiline nécessite le domaine FH1 pour réguler la processivité.

6.2 Résultats 173