Analyse quantitative

FIGURE5.5 Ce tableau regroupe tous les paramètres décrivant l’association ou la dissocia-

tion de la formine ou de CP sur un bout barbé libre ou en présence de l’autre protéine. Tableau issu de [92].

En utilisant les deux configurations, nous pouvons remonter à toutes les constantes d’association et de dissociation des deux protéines avec le bout barbé libre ou occupé par l’autre protéine. La méthode pour mesurer des taux de détachement à partir des expériences est décrite au chapitre 4. Les constantes cinétiques obtenues sont récapitulées dans le tableau ci-dessous, en figure 5.5.

Constante d’association et dissociation des protéines au bout barbé libre Pour mesu-

rer la constante d’association de la formine au bout barbé, plusieurs taux, notés kobs,

sont mesurés. Ils sont issus de modélisations, par des fonctions mono-exponentielles, des courbes de répartition représentant l’évolution de la fraction de filaments qui, au cours du temps, voient leurs vitesses d’élongation s’élever dû à l’arrivée de la formine au bout barbé, en présence d’actine-profiline. En changeant la concentration en formine, ce

kobschange, et la régression linéaire de la variation de kobs( kobs= k+F× [ f or mi ne]) en

fonction de la concentration de formines nous permet de remonter au k_+F≈ 29 µM−1.s−1. La constante de dissociation de la formine, k_−F ≈ 8.10−5.s−1, est donnée par le taux de la fonction mono-exponentielle décroissante modélisant la courbe de répartition de la fraction des formines présentes aux bouts barbés au cours du temps, qui se détachent toutes au bout d’une certaine durée. Ici, comme par la suite, le taux de dissociation est indépendant de la concentration en formine, et l’on a directement kobs= k−F.

De façon similaire pour l’effet de la protéine de coiffe, plusieurs kobssont issus des

leurs vitesses d’élongation devenir nulles à cause de la liaison de la protéine de coiffe au bout barbé. La régression linéaire de la variation de kobsen fonction de la concentration

en protéine de coiffe nous permet de remonter au k_+C≈ 12.8 µM−1.s−1.

La constante de dissociation de la protéine de coiffe, k_−C≈ 2.10−4.s−1, est donnée par le taux de la fonction exponentielle décroissante modélisant la distribution cumulée de la fraction des bouts barbés à l’élongation nulle au cours du temps, lorsque l’on expose les filaments initialement tous stoppés, à de l’actine-profiline.

Constante d’association en présence de l’autre protéine au bout barbé : formation du

complexe Étant donné que la présence de la protéine de coiffe se traduit par une élon-

gation nulle, il est simple de mesurer la constante d’association de la protéine de coiffe sur des bouts barbés allongés par la formine en présence d’actine-profiline. La valeur k_+C′ ≈ 0.21µM−1.s−1est issue de plusieurs distributions cumulées d’expériences de coiffe sur des bouts barbés allongés par des formines, faites à différentes concentrations de protéine de coiffe (voir figure 5.1).

La liaison de la formine à un bout barbé coiffé est plus difficile puisque l’on ne peut prouver la présence de la formine que lorsque la protéine de coiffe se dissocie. Partant d’une population de filaments coiffés, on expose alors à plusieurs concentrations de formine et avec plusieurs durées. Pendant l’exposition, on suppose que seule la réaction BC + F → BCF est valable, les complexes déjà formés ne se dissocient pas (on néglige les réactions BC → B + C ; BCF → BC+F ou BCF → BF + C). Puis l’on mesure la fraction de bouts barbés repartant en élongation rapide (BF). On analyse alors la fraction de bouts BF après exposition à une certaine concentration ou durée. La fraction des bouts barbés liés à la formine est augmentée avec la durée d’exposition et la concentration, et ce jusqu’à un certain plateau. Tout cela nous permet ensuite de remonter au k_+F′ ≈ 1.6 µM−1.s−1.

Constante de dissociation en présence de l’autre protéine au bout barbé : durée de vie

du complexe Pour étudier les constantes de dissociation de ce complexe, on regarde

d’un côté la cinétique (distribution cumulée) de sa durée de vie décrit par la relation

kobs= k

′

−C+ k

′

−F. On répertorie la fraction de complexes qui repartent en élongation lente

(B), indiquant que la formine s’est d’abord dissociée (BFC ou BCF → BC + F), suivie de la protéine de coiffe (BC → B + C). On répertorie également la fraction de complexes qui repartent en élongation rapide (BF), indiquant une dissociation de la protéine de coiffe uniquement. On a en effet, la relationNB F

NBC =

k′

−C

k′

−F

. Avec ces deux expressions, on peut remonter aux deux constantes de dissociations (voir figure 5.6).

5.3 Résultats 141

FIGURE5.6 Schéma montrant la relation cinétique entre chaque combinaison du bout

barbé, de la protéine de coiffe et de la formine. D’après nos observations, on note que BFC = BCF. Les valeurs sont les moyennes des paramètres regroupés dans le tableau issu de l’article (voir figure 5.5).

On retrouve des valeurs de dissociations semblables avec formines ancrées (voir figure 5.4). Ces diverses expériences ont permis de vérifier que la durée de vie du complexe et son devenir sont indépendants de l’ordre de sa formation. On a donc schématiquement BFC = BCF (voir figure 5.6).

Pour les constantes de dissociation (mesurées à 50 mM KCl, 1µM d’actine et 4µM de profiline), on note pour CapZ un facteur d’environ 10 d’augmentation lorsqu’une formine est présente au bout barbé (k_−C= 2 × 10−4s−1_{pour un bout barbé libre, à k}′

−C=

1.8 × 10−3s−1_{avec la formine au bout barbé). La constante de dissociation de la formine}

du bout barbé est augmentée environ d’un facteur 100 en présence de CapZ (on passe de k_−F= 8 × 10−5s−1_{à k}′

−F= 6.2 × 10−3s−1avec la formine au bout barbé). La présence de

l’une des deux protéines réduit ainsi fortement la durée de résidence de la seconde, leurs dissociations sont beaucoup plus rapides.