Expériences en chambre ouverte

La plupart des études en filaments uniques se basent sur l’observation de filaments, au sein de ce que l’on appelle des "chambres ouvertes" [120, 218, 220, 221]. J’ai eu plusieurs fois recours à cette méthode, pour tester l’efficacité de différentes passivations ou encore l’activité de protéines nouvellement purifiées, telle que l’actine (taux de polymérisation) ou la formine (activité de nucléation ou d’élongation).

Préparation de la chambre

Assemblage de la chambre Des lames ou lamelles (plus fines) de verre subissent dans

dans des bains placés dans un ultrasonicateur : Détergent TDF9 (2%, 30 minutes) ; Rinçage (3 fois avec de l’eau milli-Q) ; KOH (2M, 30 minutes) ; Rinçage (3 fois avec de l’eau milli-Q) ; Eau milli-Q (10 minutes) ; Éthanol absolu (20 minutes).

FIGURE4.3 Expériences en chambre ouverte. A : Schéma d’expérience. Sont représentées

une lame et une lamelle, séparées par des bandes de parafilm ou de scotch double face. On injecte la solution à l’entrée de la chambre avec une pipette (représentée par le cône), puis on aspire à la sortie avec du papier buvard ou mouchoir papier. B : Vue de coté.

Ces chambres consistent simplement en une lame et une lamelle, collées ensemble par du parafilm chauffé ou de l’adhésif double face. Plusieurs bandes de parafilm ou de scotch peuvent former plusieurs chambres (voir figure 4.3). C’est idéal pour faire, par exemple, une chambre témoin par rapport à une autre. Le volume de ces chambres varient entre 10 et 20µl. Lors d’une injection de solution, l’écart entre les parois (qui est de l’ordre de 100µm) permet à la solution de s’y insérer par capillarité puis on aide la solution à couler en l’aspirant au bout, avec un mouchoir papier par exemple, et ce jusqu’à ce que la solution soit bien homogène à l’intérieur de la chambre (voir figure 4.3). Empiriquement, un rinçage satisfaisant ce fait avec 3 ou 4 fois le volume de la chambre. Cela représente environ 50µl de tampon pour rincer quasi-totalement une solution.

Passivation BSA ou PLL-g-PEG Une fois la chambre assemblée, elle peut être passi-

vée/protégée par deux façons lors de mes expériences. On peut utiliser de la protéine globulaire BSA ("bovine serum albumin"), concentrée à 5 % (50 mg/ml). Après incubation jusqu’à une demi-heure, puis rinçage par l’eau ou la solution tampon (voir annexe 1), la protéine globulaire BSA se lie à la surface de façon non-spécifique et la recouvre, empê- chant de cette façon la liaison non spécifique de protéines avec le verre (voir figure 4.5). De la BSA est par la suite ajoutée en faibles quantités dans les diverses solutions injectées dans la chambre pour les expériences. Cela évite au maximum une dégradation de la passivation, qui peut arriver par décollement de certaines BSA.

Le PLL-g-PEG (poly(l-lysine)-graft-poly(éthylène glycol)) forme une brosse de poly- mères PEG à la surface (voir figure 4.13). Il est utilisé de la même façon que la BSA. Avant

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incubation en revanche, une étape d’activation de la surface par un plasma cleaner ou par un traitement à l’UV est nécessaire, contrairement au cas d’utilisation de la BSA. Cette activation se fait notamment par création de radicaux libres chargeant la surface néga- tivement, attirant électrostatiquement ou pouvant probablement lier covalemment les chaînes chargées positivement de poly-lysine [246].

Comme nous le verrons, la passivation peut-être également complétée par des pro- téines BSA biotinylées (voir figure 4.5) ou chaînes de PLL-g-PEG biotinylées (voir fi- gure 4.13). Ces biotines, ainsi ancrées à la surface de passivation, servent à lier spéci- fiquement des protéines, via l’intermédiaire de protéines streptavidines ou neutravidines (une homologue à la streptavidine). Ce lien non-covalent biotine-streptavidine est remar- quable car il résiste à des forces de l’ordre d’une centaine de piconewton [247].

Après une étape de rinçage avec la solution tampon, les solutions échantillons peuvent être ajoutées dans la chambre.

Observation des filaments

Pour initier l’assemblage des filaments à partir des solutions de monomères, on rajoute du sel et du magnésium en excès, ainsi que de l’EGTA, séquestrant les ions Ca2+, accélérant de cette façon l’échange entre les ions Ca2+ et Mg2+ au sein des monomères. Cela change alors le tampon G en tampon F (F pour Filament).

Filaments libres Les filaments préformés en solution, avec une certaine fraction de

monomères marqués (de 10 à 20 %), ont tendance à diffuser en 3 dimensions une fois injectés dans la chambre, lorsque leurs deux bouts sont libres. On rajoute en solution des agents ségrégants, telle que la méthylcellulose, pour qu’ils soient maintenus à proximité de la surface. Cela permet une observation optimale en microscopie TIRF (voir figure 4.4. A) ou en microscopie à épi-fluorescence dans le cas où les monomères fluorescents en solution ont été rincés de la chambre.

Ancrage par un bout On peut également ancrer le filament à la surface. L’ancrage par

un seul bout n’empêche pas le reste du filament de fluctuer. La méthycellulose sera toujours nécessaire pour observer convenablement la dynamique de l’autre bout près de la surface et pour observer tout le contour du filament, qui apparaît flou autrement (voir figure 4.4.B).

Des protéines se liant à un bout ou l’autre du filament peuvent être fixées non- spécifiquement à la surface de verre préalablement à la passivation à la BSA. Si les protéines sont marquées avec des molécules biotinylées, elles peuvent être ancrées de

FIGURE4.4 L’effet de la méthylcellulose sur les expériences en chambre ouverte. A : Ob-

servations de filaments préformés à partir d’une solution d’actine marquée à 20% d’Alexa 594. Microscopie TIRF, passivation à la BSA et utilisation de 0.2% de méthycellulose. B : Observation en microscopie à épi-fluorescence après rinçage des monomères, passivation au PLL-g-PEG, sans méthylcellulose. La partie non ancrée des filaments diffuse dans la solution, hors du point focal, créant cet aspect flouté. Les filaments sont ici ancrés par des amorces biotinylées, montrées par des flèches.

manière spécifique via la streptavidine ancrée à BSA biotine ou au PLL-g-PEG biotine, comme mentionné précédemment. Des séquences d’acides aminés spécifiques rajoutées génétiquement à la protéine (telle que l’étiquette ploly-histidine ou la protéine GST pré- cédemment utilisée par l’équipe [102] ) interagissent avec des anticorps secondaires. Si ces derniers sont biotinylés, ils peuvent servir d’intermédiaire d’ancrage (voir figure 4.5). C’est le cas pour l’anticorps Penta·His Biotin Conjugate, qui peut se lier à une streptavi- dine de surface et lier l’étiquette ploly-histidine. Ces séquences peuvent être également directement biotinylées (tel que l’étiquette SNAP, voir figure 4.13.B).

Protéines d’ancrage par le bout On pourra se référer à la figure 4.5 pour plus de clarté. L’ancrage par le bout pointu peut se faire en utilisant des amorces, purifiées à partir de globules rouges humains (voir figure 4.5.A). Leur composition ne nous est pas totalement connue mais elles contiennent des protéines spectrines, ainsi que de l’actine. Leur struc- ture permet une élongation du filament seulement par le bout barbé. Elles permettent de générer des filaments, sans nucléation nécessaire [248].

De l’autre côté, l’ancrage par le bout barbé peut se faire en utilisant un complexe gelsoline-actine (GA2, voir figure 4.5.B). L’ancrage du bout barbé peut aussi se faire en ancrant des protéines spécifiquement. Par exemple, après biotinylation de la protéine, elle peut s’ancrer via une streptavidine accrochée à de la BSA-biotine (voir figure 4.5.C), ou même du PLL-g-PEG-Biotine (voir figure 4.8).

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FIGURE4.5 Différentes protéines d’ancrage mènent à plusieurs configurations. A et B :

L’utilisation d’amorces spectrines (bout pointu ancré (A)) ou de complexes GA2 (bout barbé ancré (B)) se fait précédemment la passivation à la BSA . C : La passivation à la BSA-biotine, permet, via la streptavidine un ancrage spécifique de protéines biotynilées, comme c’est le cas ici avec une amorce biotinylée.

Protéines d’ancrage par le côté L’utilisation de myosine-NEM (N-ethylmalaeimide),

dont la fonction motrice est inactive [249], permet de lier le coté du filament tout en laissant ses bouts pointu et barbé libres à la polymérisation ou dépolymérisation [237]. Cet ancrage le long du filament permet d’éviter l’utilisation de méthycellulose.

Les limitations des expérience en chambres ouverte

L’utilisation de la méthycellulose n’a pas d’influence directe sur les cinétiques de poly- mérisation ou dépolymérisation des filaments. Mais ce sont des polymères, qui peuvent stériquement gêner l’interaction entre deux protéines, ou stimuler le regroupement en faisceaux de filaments [250].

De plus, le filament est rapproché de la surface à la fois par un ancrage par l’un de ses bouts et l’utilisation de la méthycellulose ou bien l’ancrage seul par la myosine-NEM. L’inconvénient est qu’une trop grande proximité avec la surface peut gêner l’interaction avec des protéines régulatrices, notamment des protéines venant se lier sur le côté du filament (ex : la tropomyosine).

Il a ainsi été observé que de trop grandes interactions avec la surface provoquent des pauses dans la dépolymérisation du filament [73]. Ces pauses pourraient également venir des multiples points d’ancrage dans le cas de l’utilisation de myosines-NEM [237]. Dans ce dernier cas, l’action de protéines sur le filament pourra potentiellement être également modifiée par une réduction de liberté conformationnelle entre deux points d’ancrage rapprochés.

Enfin, même si le volume total de la chambre est seulement de l’ordre de 10 à 15µl, le changement de conditions biochimiques à l’intérieur est très lent, l’homogénéisation d’une nouvelle solution prend jusqu’à une minute. Ce temps comprend principalement le temps d’injection et d’aspiration (voir figure 4.3). C’est une contrainte importante à prendre en compte lors de l’étude des effets de protéines régulatrices, ou lors de change- ment de conditions dans les chambres [250].