Expression du récepteur aux IgE humaines par les cellules RBL SX-38

L’expression du FcεRI par les cellules RBL SX-38 est contrôlée après chaque décongélation et au bout d’une vingtaine de repiquages des cellules afin de s’assurer de la stabilité de la lignée. L’expression de la chaîne α est contrôlée par technique de cytométrie en flux et celle de la chaîne β par technique d’immunoempreinte. Du fait de l’indisponibilité commerciale d’anticorps anti-chaîne γ du FcεRI humain, son expression n’a pas été vérifiée.

II.4.2.1. Contrôle de l’expression de la chaîne α du FcεRI humain par cytométrie en flux

Après incubation successive des cellules avec un anticorps monoclonal de souris anti- chaîne α du FcεRI humain, puis avec un anticorps secondaire marqué à un fluorophore (Fluorescéine Iso Thio Cyanate (FITC)), les cellules sont analysées en cytométrie en flux (FACS Calibur, Becton-Dickinson). Différents paramètres sont ainsi mesurés pour les cellules : leur taille, leur granulométrie et l’intensité de fluorescence correspondant à la densité de surface de la chaîne α du FcεRI humain.

Des cellules RBL SX-38 et des cellules RBL 2H3 (servant de contrôle négatif) pré- confluentes sont lavées en PBS et sont ensuite incubées pendant 45 min à 4°C avec une solution de dissociation (PBS contenant 0,02% d’EDTA) et les cellules sont délicatement décollées par pipetage modéré. Après centrifugation (400 g, 10 min, 4°C), le culot cellulaire est repris en PBS. Les cellules sont ensuite comptées sur cellules de Malassez et le volume de PBS est ajusté afin d’obtenir une concentration de 3,5.105 cellules/mL. Après une nouvelle centrifugation (400 g, 5 min, 4°C), 100 ng de l’anticorps primaire sont ajoutés au culot cellulaire (100 µL par tube, dilué en solution de lavage (PBS contenant 1% de SAB)). Un

marquage est réalisé avec un anticorps monoclonal de souris anti-chaîne α du FcεRI humain, (clone AER37, eBioscience) et en parallèle, un contrôle isotypique est réalisé avec un anticorps de souris de même isotype (IgG2b). Les suspensions cellulaires sont homogénéisées puis incubées pendant 1 h à 4°C. Après 3 lavages en solution de lavage, le culot cellulaire est repris par 100 µL de l’anticorps secondaire (chèvre anti-IgG de souris conjugué à la FITC (F(ab’)2 goat anti-mouse IgG (H+L) – FITC, Jackson Immunoresearch), 5 µg/mL en solution de lavage). Après 1 h d’incubation, à 4°C, à l’obscurité, les cellules sont lavées. Les cellules sont finalement reprises dans 500 µL de FACS-flow (BD Bioscience).

Les cellules sont analysées en cytométrie en flux (FACS Calibur, Becton Dickinson). Les réglages du cytomètre sont paramétrés en fonction du contrôle isotypique réalisé avec les cellules RBL SX-38. Les résultats sont exprimés par le pourcentage de cellules positives et/ou par la moyenne de l’intensité de fluorescence mesurée. Les résultats peuvent également être exprimés selon le rapport d’intensité de fluorescence (RFI) entre les cellules marquées par l’anticorps anti-chaîne α du FcεRI humain et les cellules marquées par l’anticorps contrôle isotypique.

II.4.2.2. Contrôle de l’expression de la chaîne β du FcεRI humain

L’expression de la chaîne β du FcεRI a également été mesurée par technique de cytométrie en flux. Le protocole est le même que précédemment à l’exception d’une étape de perméabilisation des cellules préalable aux marquages. Elle est effectuée car l’épitope reconnu par l’anticorps anti-chaîne β du FcεRI humain est intracellulaire. Cette perméabilisation des cellules est réalisée en incubant 30 min à 4°C les cellules avec 500 µL de PBS contenant 1% de Triton X-100 suivi de deux cycles de lavage. L’anticorps primaire de marquage est un anticorps polyclonal de lapin anti-chaîne β du FcεRI humain (Upstate biotechnology) dilué au 1/1000 et l’anticorps secondaire de chèvre anti-IgG de lapin conjugué à la FITC (F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG (H+L) – FITC, Jackson Immunoresearch) dilué à 5 µg/mL.

L’expression de la chaîne β est confirmée par immunoempreinte : des lysats cellulaires réalisés à partir des cellules RBL SX-38 et, en contrôle, des cellules RBL 2H3, sont séparés par électrophorèse SDS-PAGE. Après transfert des protéines du gel sur une

membrane, la bande correspondant à la chaîne β du FcεRI humain est révélée par incubation avec un anticorps polyclonal de lapin spécifique de cette sous unité humaine.

• Lyse des cellules et dosage protéique : les cellules RBL SX-38 ou RBL 2H3 pré- confluentes sont lysées avec du tampon Laemmli sans β-mercaptoéthanol et sans bleu de bromophénol (tampon Tris 62,5 mM pH 6,8 contenant 1% de SDS et 10% de glycérol). Les échantillons sont alors dilués en tampon de phosphate de potassium 50 mM pH 7,4 pour le dosage protéique effectué grâce au kit BCA (Pierce), selon les instructions du fournisseur. • Electrophorèse SDS-PAGE : après addition de β-mercaptoéthanol (2,5%) et de bleu de bromophénol (0,0025%), les échantillons sont chauffés pendant 10 min à 95°C. Cinq microgrammes de protéines sont déposés par puits de migration et séparés par électrophorèse SDS-PAGE avec un système vertical Mini Protean III (Biorad) suivant la méthode de Laemmli [361] modifiée par Dean et coll. [362]. Les protéines des extraits sont séparées sur des gels de migration constitués de 12% d’acrylamide. Un gel de pré-concentration (Stacking-gel) à 5% d’acrylamide est coulé au-dessus du gel à 12%. Le marqueur de masse moléculaire utilisé couvre une gamme variant de 4 kDa à 148 kDa (SeeBlue Plus2 Pre- Stained Standard, Invitrogen). La migration s’effectue en tampon composé de 25 mM de Tris pH 8,3 et contenant 0,1% de SDS et 192 mM de glycine. L’intensité imposée est de 15 mA/gel, jusqu’à ce que le front de migration passe le gel de pré-concentration, puis de 30 mA/gel pendant le reste de la migration. Deux gels de migration sont réalisés en parallèle. Un des gels est révélé par coloration au bleu de coomassie G-250 suivant les instructions données par le fournisseur (GelCode® Blue Stain Reagent, Pierce). L’autre gel est utilisé pour réaliser l’immunoempreinte.

• Transfert sur membrane et immunoempreinte : immédiatement après l’électrophorèse, le gel est équilibré dans du tampon de transfert (Tris 25 mM, glycine 192 mM, éthanol 10%) pendant 15 min. Le transfert des protéines sur membrane PVDF (PolyVinylDiFluoride) s’effectue grâce à un champ électrique de 36 V pendant 90 min dans le tampon de transfert. La membrane contenant les protéines transférées est ensuite saturée par incubation avec du tampon TBST (tampon TBS (Tris 20 mM, NaCl 250 mM) contenant 0,5% de Tween 20) auquel est ajouté 5% (m/v) de lait écrémé en poudre (TBST-lait) permettant de bloquer tous les sites de fixation potentiels non utilisés de la membrane. La membrane est ensuite incubée sur la nuit à 4°C avec l’anticorps primaire (anticorps polyclonal de lapin anti-chaîne β du FcεRI humain, Upstate biotechnology) dilué au 1/10000. Après 3 lavages de 15 min avec le tampon TBST-lait, la membrane est incubée avec l’anticorps secondaire (anticorps de chèvre

anti-IgG de lapin conjugué à la péroxydase ; peroxydase conjugated AffiniPure goat anti- rabbit IgG (H+L), Jackson ImmunoResearch) dilué au 1/25000 pendant 2 h. La membrane est ensuite rincée (2 lavages de 15 min) avec le tampon TBST puis avec le tampon TBS (2 lavages de 15 min). L’activité de la peroxydase est révélée par incubation pendant 1 min avec une solution contenant du luminol selon les instructions du fournisseur (ECL West Dura Trial Kit, Pierce). Un film photographique est alors apposé sur la membrane (X-OMAT, Kodak), puis développé.