Etudes in vivo - Imagerie des tumeurs greffées en sous-cutanée exprimant la

2.1 Modèle animal

Toutes les procédures d’expérimentation animale ont été acceptées par le comité d’éthique de l’Université Grenoble Alpes (Cometh Grenoble, CEEA n°12) et autorisées par le ministère l’enseignement supérieur, de la recherche et de l’innovation (MESRI). Des souris femelles BALB/c nude (Janvier Lab) ont été utilisées pour les différentes expérimentations. Ces souris présentent une aplasie du thymus, et sont donc de ce fait déficientes en lymphocytes T (LT) matures. Cette absence de LT matures va faciliter le développement des tumeurs humaines xénogreffées sur la souris. Du fait de cette immunodéficience, les souris ont été placées dans des cages avec un filtre, dans une armoire ventilée autonome, à 25 °C et 30 à 50 % d’hygrométrie. La nourriture et l’eau de boisson ont été stérilisées et fournies ad libitum. Les cages, les litières et l’eau ont été changées à raison de 2 fois par semaine. Lors de leur manipulation (suivi de poids, suivi de la croissance tumorale) les souris ont été placées sous une hotte à flux laminaire.

Les cellules cultivées dans leur milieu respectif ont été amplifiées. La veille de l’implantation tumorale, le milieu de culture cellulaire a été renouvelé pour optimiser l’état des cellules. Les souris âgées de 5 semaines ont été implantées au niveau de la patte arrière gauche par voie sous-cutanée avec 3,5 millions de cellules HCC70 (n=22) ou 2 millions de cellules MDA-MB-231 (n=10) dans un mélange

PBS-Matrigel® haute concentration (Matrice Corning Matrigel®) 2:1, dans un

volume final de 180 µL, à l’aide d’une seringue 26 G. L’implantation tumorale en

Matrigel® nécessitant de travailler à 4 °C, ce dernier a été placé au réfrigérateur

12 h avant l’implantation afin qu’il devienne liquide, et le matériel nécessaire (seringues, cônes, tubes) a été placé au congélateur. L’implantation s’est déroulée

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 Suivi de la croissance tumorale

Après l’implantation, les souris ont été quotidiennement observées. Elles ont également été pesées à raison de 3 fois par semaine. Dès l’apparition des tumeurs, le volume tumoral a été mesuré à l’aide d’un pied à coulisse à lecture digitale

(précision 10-2 mm, Fischer Darex). La longueur, la largeur ainsi que la hauteur

(ou épaisseur de la tumeur) ont été mesurées.

Afin d’obtenir le volume tumoral, la formule du volume d’un ellipsoïde a été appliquée :

𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 = (𝐿𝑜𝑛𝑔𝑢𝑒𝑢𝑟 × 𝐿𝑎𝑟𝑔𝑒𝑢𝑟 × 𝐸𝑝𝑎𝑖𝑠𝑠𝑒𝑢𝑟) × 𝜋/6

A partir de ce volume tumoral, le temps de doublement tumoral a pu être déterminé. Ce temps de doublement (TD) est donné grâce à la formule suivante, avec V2 représentant le volume tumoral final, V1 le volume tumoral initial, t2 le temps de la mesure finale, et t1 le temps de la mesure initiale :

 Point limite de l’étude

Un volume tumoral de 1500 mm3 a été défini comme point limite pour cette

étude, conformément aux recommandations du comité d’éthique local. L’étude a

été conduite sur des volumes tumoraux compris entre 200 et 600 mm3. Ce point

limite n’a donc pas été atteint. Par ailleurs, tout signe de faiblesse, de prostration de l’animal ou encore une perte de poids > 20 % ont également été considérés comme des points limites à l’étude. Aucun animal n’a atteint un point limite lors de cette étude.

ln 2

ln (V2/V1)

t2-t1

TD =

( )

142 2.2 Injection du radiotraceur

Dès que la tumeur a atteint un volume compris entre 200 et 600 mm3, les

animaux ont été placés 1-2 minutes près d’une lampe à infrarouge, source de chaleur, afin de dilater les veines latérales de la queue. Les souris ont alors été

placées dans un tube à contention et injectées avec le radiotraceur 99mTc-A1, 99m

Tc-C6 ou 99mTc-Ctle, par voie veineuse. Les différents groupes constitués sont rappelés

dans le tableau ci-dessous.

Tumeur implantée Nombre de souris Molécules injectées Activités injectées (MBq) Volume tumoral (mm3) le jour de l’injection HCC70 8 99mTc-A1 52,5 ± 9,6 481 ± 109 7 99mTc-C6 59,4 ± 6,1 344 ± 75 7 99mTc-Ctle 46,8 ± 11,2 485 ± 173 MDA-MB-231 ⁶ 99mTc-A1 68,5 ± 11,8 252 ± 33 4 99mTc-Ctle 61,6 ± 8,5 212 ± 45

Tableau 7. Les différents groupes de souris injectées avec 99mTc-A1, 99mTc-C6 et 99mTc-Ctle.

2.3 Imagerie corps entier et quantification de la fixation tumorale

Une heure après l’injection du radiotraceur, les animaux ont été anesthésiés à l’isoflurane 2 % dans un mélange oxygène/air 1:1 et l’imagerie TEMP/TDM a été réalisée à l’aide de la caméra nano-SPECT-CT, caméra pré-clinique dédiée au petit animal (Bioscan/Mediso). Durant l’acquisition, la température des animaux a été régulée et leur fréquence respiratoire monitorée afin d’ajuster, si nécessaire, le degré d’anesthésie. Une imagerie tomodensitométrique (TDM, rayons X) a d’abord été réalisée avec les paramètres suivants : 45 kV, 240 projections, 500 ms par projection, puis une acquisition TEMP de 45 minutes du corps entier a été réalisée : 24 projections, 200 ms par projection. Dès la fin des acquisitions, les acquisitions TEMP et TDM ont été reconstruites afin d’obtenir des volumes tridimensionnels, puis elles ont été fusionnées à l’aide du logiciel Nucline (Nucline/Mediso). Les quantifications ont été effectuées à l’aide du logiciel Vivoquant (InVicro). Afin de

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quantifier la fixation tumorale des traceurs, un volume d’intérêt (sphère de 50

mm3) a été défini en se basant sur les images anatomiques obtenues grâce à

l’imagerie TDM. Un exemple du placement de ce volume est présenté ci-dessous (figure 74). Les résultats de la fixation tumorale du traceur ont été exprimés en %

de la dose injectée rapporté au volume du tissu (% DI/cm3). Cette grandeur

correspond à l’activité captée par centimètre cube de tissu, corrigée de la dose

injectée (en MBq). On considère que 1 cm3 ≈ 1 g pour les différents organes étudiés.

2.4 Etudes de biodistribution

Deux heures après l’injection du radiotraceur, et directement après l’imagerie TEMP/TDM, une biodistribution par prélèvements d’organes a été réalisée. Les animaux, toujours anesthésiés, ont été euthanasiés par inhalation de

CO2, puis les organes ont été prélevés, pesés et placés dans des tubes de comptage.

La radioactivité a été comptée au compteur gamma (Wizard2, PerkinElmer). La

fixation dans les différents organes a été corrigée du poids de l’organe, de la décroissance radioactive et de la dose injectée (MBq). Les résultats ont été exprimés en % DI/g de tissu.

Figure 74. Exemple de positionnement du volume d'intérêt au sein de la tumeur sur des coupes transversales de TEMP/TDM. La tumeur est pointée par la flèche blanche. A gauche, une imagerie TDM, au centre l’imagerie TDM avec le positionnement de la région d’intérêt en rouge, et à droite l’imagerie TDM fusionnée à l’imagerie TEMP.

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