Culture cellulaire

Deux lignées cellulaires humaines de cancer du sein triple négatif ont été utilisées dans cette étude. Ces deux lignées sont les MDA-MB-231 et les HCC70. Elles ont été sélectionnées en fonction de leur phénotype (ER-, PR-, HER2-), l’expression de la mésothéline, mais aussi pour leur capacité à former des tumeurs lors de xénogreffes chez des souris immunodéficientes.

 MDA-MB-231

La lignée MDA-MB-231 est une lignée tumorale humaine établie à partir d’effusions pleurales d’une patiente de 51 ans de type caucasien présentant un adénocarcinome triple négatif du sein métastatique (Réf ATCC : HTB-26). Ces cellules sont adhérentes et de morphologie épithéliale (figure 72). Elles se développent en monocouches. Cette lignée de cellules est hautement métastatique lorsqu’elle est greffée au niveau de la glande mammaire chez des souris immunodéficientes (Iorns et al., 2012).

Les cellules MDA-MB-231 ont été cultivées dans du milieu Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) contenant de la L-glutamine (2 mM), du sodium

pyruvate (1 mM) et du NaHCO3 (1,5 g/L) (PAN BIOTECH). Ce milieu a été

supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal (SVF South America, Lot S1163651810, Dutscher) et avec 1 % de Pénicilline-Streptomycine. Le temps de

doublement indiqué par le fournisseur (ATCC®) pour cette lignée est d’environ 38

h. L’expression de la MSLN par ces cellules est sujette à controverse. Des études ont montré que les cellules MDA-MB-231 expriment faiblement la MSLN tandis que d’autres ont montré qu’elles ne l’expriment pas (Alewine et al., 2014 ; Uehara, Matsuoka, and Tsubura, 2008).

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 HCC70

La lignée HCC70 est une lignée humaine établie à partir d’une patiente de 49 ans de type Africain présentant un cancer du sein canalaire invasif (Réf ATCC : CRL-2315). Elle est issue d’une tumeur de stade III, ce qui signifie que la tumeur a commencé à envahir les tissus environnants et notamment les ganglions régionaux : cette lignée est donc issue d’un carcinome métastatique. Les cellules HCC70 sont également épithéliales et se développent en monocouches (figure 73). Les cellules HCC70 ont été cultivées dans du milieu RPMI-1640 contenant de la L-glutamine (2 mM), du sodium pyruvate (1 mM), de l’HEPES (10 mM), du NaHCO3 (1,5 g/L) (PAN BIOTECH No : P04-18047). Ce milieu a été supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de Pénicilline-Streptomycine. Le temps de doublement indiqué est d’approximativement 73 heures. Ces cellules sont connues pour fortement exprimer la MSLN (Alewine et al., 2014).

Figure 72. Clichés de cellules MDA-MB-231 observées par microscopie optique en contraste de phase (ATCC).

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Les cellules HCC70 et MDA-MB-231 ont immédiatement été mises en culture à leur réception.

- La décongélation

La décongélation s’est effectuée par un chauffage au bain marie à 37 °C pendant 2 min. Les cellules ont été resuspendues dans leurs milieux respectifs complets préchauffés, puis transférées dans un tube de centrifugation (15 mL). Elles ont alors été sédimentées par centrifugation à 200 g pendant 5 min. Elles ont ensuite été reprises dans 5 mL de milieu complet, puis ensemencées dans une boite de culture (T-25). Le lendemain, le milieu de culture a été remplacé par du milieu frais afin d’éliminer les déchets cellulaires.

- La congélation

Des lots de réserve ont été établis et conservés dans l’azote liquide à –196 °C. La congélation s’est effectuée à raison de 2,5 à 3 millions de cellules dans des cryotubes (1 mL), en présence d’un cryoprotecteur, le Diméthylsulfoxyde (DMSO) à 10 %, de SVF (15 %), dans du milieu de culture complet spécifique à chaque lignée. Le volume final est de 1 mL par cryotube. La congélation des cellules s’est faite de façon progressive et en plaçant les cryotubes dans une boite contenant du

Figure 73. Clichés de cellules HCC70 observées par microscopie optique en contraste de phase (ATCC).

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propane-2-ol à -80 °C (Mr Frosty, Cryo 1 °C Freezing container, NalgenTM). Ceci

permet une diminution progressive de la température de 1 °C par minute. Vingt-quatre heures plus tard, les cellules ont été transférées dans de l’azote liquide et stockées jusqu’à la prochaine décongélation.

- Entretien des cellules

Dès que les cellules sont arrivées à confluence, le milieu de culture a été

aspiré, les cellules rincées avec du PBS sans Ca2+ et sans Mg2+, puis recouvertes

avec une solution de trypsine 0,05 %, EDTA 0,02 % contenue dans du PBS sans

Ca2+ et sans Mg2+. Elles ont alors été placées 5 minutes dans un incubateur à 37

°C sous atmosphère humide contenant 5 % CO2. L’action de la trypsine a été

stoppée par l’ajout de milieu complet (5 fois le volume de trypsine). Les cellules ont alors été reprises dans un tube de centrifugation et sédimentées par centrifugation à 200 g pendant 5 minutes. Elles ont alors été diluées et réparties dans de nouvelles boites, et enfin placées dans un incubateur à 37 °C sous atmosphère humide

contenant 5 % CO2. A noter que les cellules HCC70 ont nécessité un

renouvellement complet de milieu tous les 2 jours.

- Evaluation de la viabilité cellulaire

La viabilité cellulaire des lignées MDA-MB-231 et HCC70 a été régulièrement mesurée par la mesure de l’incorporation du bleu trypan qui colore les cellules mortes. La viabilité peut ainsi être estimée de la manière suivante :

% 𝑑𝑒 𝑣𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑡é = (1 − ^{𝑛𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑢𝑙𝑒𝑠 𝑏𝑙𝑒𝑢𝑒𝑠}

𝑛𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑢𝑙𝑒𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠^{) × 100}

La mesure de la viabilité cellulaire permet de contrôler l’état général des cellules. Une viabilité cellulaire supérieure à 95 % est considérée comme étant satisfaisante.

- Détermination du temps de doublement cellulaire

Outre la viabilité cellulaire, le temps de doublement (ou temps de génération, TG) renseigne également de l’état général des cellules. Il se définit

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comme l’intervalle de temps nécessaire pour que la quantité de cellules double pendant la phase de croissance logarithmique.

Il a été calculé de la façon suivante :

𝑇𝐺 = ^{𝑙𝑜𝑔2 × 𝑇}

log 𝑌 − 𝑙𝑜𝑔𝑋

T est l’intervalle de temps (en heures ou en jours) écoulé entre le jour d’ensemencement des cellules (J 0) et le jour du comptage. Y représente le nombre de cellules au jour de comptage et X le nombre de cellules à J 0.