Etudes chez l’animal

L’étude de l’effet de la PVL purifiée chez l’animal a été réalisée chez le lapin et la souris dans les années 1970. En 1976, il a été montré que l’injection de PVL provoquait chez le lapin une leucopénie transitoire, dose-dépendante, accompagnée d’une déplétion de la lignée myéloïde. Cette leucopénie ne s’accompagnait cependant pas de symptômes particuliers et était suivie d’une leucocytose avec granulocytose (Szmigielski et Jeljaszewicz, 1999). Lorsque que la PVL est injectée par voie intradermique au lapin, elle provoque des lésions de dermo-nécrose dont l’intensité dépend de la dose injectée (Ward et Turner, 1980 ; Cribier et al, 1992). Chez les souris, l’effet de la PVL semble nettement moins marqué, probablement en partie du fait d’une fixation, à concentration égale, 10 fois moins importante de la PVL sur les PNN murins par rapport à celle observée chez le lapin ou sur les PNN humains (Szmigielski et al, 1999). L’injection intraveineuse chez la souris ne semble pas s’accompagner de leucotoxicité mais provoque cependant une certaine réaction inflammatoire puisqu’elle s’accompagne d’une augmentation transitoire des leucocytes. (Grojec et Jeljaszewic, 1981). Bien que les effets de la PVL chez la souris semblent assez éloignés de ce que l’on observe chez l’homme, beaucoup de travaux récents ont cherché à déterminer les effets propres de la PVL à partir de modèles murins.

a) Modèles murins de pneumonie à S.aureus PVL+

En 2006, Voyich et al ont étudié les effets de la PVL à partir d’un modèle de septicémie chez la souris exposée à différentes souches de SARM exprimant ou non la PVL. Dans ce modèle, la souche clinique USA400, PVL+ était associée à une virulence plus importante alors que d’autres souches PVL+ ne montraient pas de différence avec des souches homologues PVL négatives. De même, les souches PVL+ sauvages USA300 et USA400 n’apparaissaient pas plus virulentes que leurs homologues isogéniques délétées des gènes codant la PVL dans ce modèle de sepsis ainsi que dans un modèle d’infection cutanée (Voyich et al, 2006). Les

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auteurs concluaient en considérant la PVL comme un marqueur épidémiologique associé aux souches de SARM-C mais que la virulence de ces souches n’était pas due à la production de cette toxine (Voyich et al, 2006). Ces travaux ont été abondamment repris dans la littérature même s’ils présentaient de nombreuses faiblesses. En effet, le mode d’inoculation choisi (injection intraveineuse directe) ne correspond en réalité pas aux pathologies les plus sévères observées chez l’homme à savoir les infections ostéo-articulaires et les pneumonies. De même, l’inoculation intradermique directe peut paraitre appropriée pour évaluer une infection cutanée mais reproduit en fait une infection secondaire à une rupture de la fonction « barrière » de la peau alors que les infections humaines à S. aureus PVL+ sont précisément caractérisée par leur caractère primitif, sans lésion cutanée préalable (Lina et al, 1999 ; Del Giudice et al, 1999 ; Daskalaki et al, 2010). Enfin et surtout, l’utilisation de la souris est peu appropriée à l’évaluation de la virulence de la PVL étant donné que les PNN murins sont très peu sensibles aux effets de cette toxine.

Cependant, d’autres études réalisées chez la souris ont montré des résultats beaucoup plus évocateurs d’une responsabilité directe de la PVL dans certaines infections sévères à S. aureus. Ainsi, Labandeira-Rey et al ont publié le premier modèle de pneumonie nécrosante en 2007 via l’instillation de 107 UFC de S. aureus par voie intranasale à des souris BALB/c (Labandeira-Rey et al, 2007). Les auteurs ont utilisé la souche RN6390 et son homologue lysogénisé avec le phage φSLT ainsi que cette souche lysogénisée dans laquelle les gènes lukSF-PV étaient délétés. Les souris infectées par les souches PVL+ ont présenté un aspect histopathologique des poumons assez proche de celui observé chez l’homme avec des lésions épithéliales importantes et des aspects de nécrose hémorragique alors que les souris infectées par la souche PVL- ne montraient pratiquement pas de lésions. Néanmoins, la survie des souris n’était significativement diminuée que lorsqu’elles étaient exposées à une souche sur-exprimant la PVL via un plasmide multicopies ce qui traduit probablement là-encore le manque de sensibilité de la souris à la PVL (Labandeira-Rey et al, 2007). D’autres études, réalisées avec des conditions expérimentales relativement proches, n’ont pas permis de confirmer les résultats obtenus par Labandeira-Rey et al. Ainsi, Bubeck-Wardenburg et al n’ont observé aucune différence de gravité dans leur modèle murin de pneumonie entre l’instillation d’une souche LAC issue du clone de SARM-C USA300 et celle de son homologue LACΔpvl. Dans les deux groupe, les souris n’ont présenté aucun signe d’infection active ainsi que l’atteste la quasi absence de lésions pulmonaires et les décomptes bactériens

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remarquablement bas observés au niveau des poumons, quelle que soit la souche instillée (Bubeck-Wardenburg et al, 2008). Les auteurs concluaient donc à l’absence de lien entre PVL et virulence et la même équipe a attribué les résultats de Labandeira-Rey et al à une hypothétique mutation dans le système agr induisant une surexpression globale de tous les facteurs de virulences régulés par ce système (Villaruz et al, 2008). L’existence d’une telle mutation n’a cependant pas été confirmée lors des contrôles et les résultats obtenus par Labandeira-Rey et al ont pu être reproduits aussi bien avec les souches utilisées lors de l’étude initiale (Vandenesch et al, 2010) qu’en utilisant dans le même modèle le couple de souches LAC/LACΔpvl avec lequel Burbeck-Wardenburg et al n’avaient pu obtenir de lésion significative. Ainsi, Brown et al ont observé une mortalité à 48h de 72% dans le groupe de souris ayant reçu une instillation intranasale de 108 CFU de souche LAC alors que la mortalité n’était que de 19% dans le groupe ayant reçu la souche LACΔpvl (Brown et al, 2009). De plus, les anticorps dirigés spécifiquement contre la PVL, obtenus après immunisation préalable par des protéines LukS-PV et LukF-PV recombinante, protégeaient les souris vis-à-vis des effets de l’infection, attestant du rôle joué par la PVL dans la genèse des lésions pulmonaires. Au-delà de la bataille d’experts qu’ils ont suscités, ces résultats discordants illustrent les insuffisances des modèles murins pour l’exploration des infections potentiellement liées à la PVL. Ces insuffisances ont été soulignées par plusieurs auteurs (Lee et al, 2010 ; Iverson et al, 2011) et, très récemment, il a été montré que la souris était possiblement et de façon globale, un modèle peu approprié à l’étude des infections bactériennes humaines. En effet, en étudiant l’expression de plus de 4000 gènes impliqués chez l’homme dans les réponses inflammatoires non spécifiques après agression, Seok et al, ont comparé cette expression avec celle des gènes homologue chez la souris dans des conditions similaires (Seok et al, 2013). Cette étude montre qu’il existe une corrélation relativement bonne entre les gènes exprimés ou réprimés chez l’homme après un traumatisme, une brûlure ou lors d’une endotoxinémie expérimentale (97% des gènes étudiés s’expriment de façon comparable entre traumatisme et brûlure et 88% entre traumatisme et endotoxinémie). Cette corrélation est également retrouvée chez la souris mais par contre, lorsque l’on compare les réponses de chaque espèce à une situation donnée, la corrélation est quasiment nulle, certains gènes surexprimés chez l’homme étant réprimés chez la souris et vice-versa. Les auteurs concluent donc que, alors que la réponse systémique à une agression est relativement univoque aussi bien chez l’homme que chez la

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souris, ce qui renforce le concept de Syndrome de Réponse Inflammatoire Systémique ; il est extrêmement hasardeux de comparer les réponses d’espèces aussi différentes que l’homme et la souris, même si ces réponses semblent phénotypiquement proches (Seok et al, 2013). Or, dans le cadre des pneumonies nécrosantes staphylococciques, les modèles murins ne parviennent que très difficilement à reproduire le phénotype observé chez l’homme à savoir l’obtention d’une pneumonie associée à une nécrose épithéliale, des lésions hémorragiques et à une leucopénie et il est donc probable que les observations faites chez la souris soient très éloignées de la pathogénie des lésions humaines.

b) Pneumonies nécrosantes chez le lapin

Pour contourner les difficultés engendrées par la faible sensibilité des PNN de souris à la PVL, il apparaissait logique de s’orienter vers des espèces plus sensibles à la toxine comme le lapin. En effet, la PVL est capable d’induire chez le lapin une lyse des PNN comparable à celle observée chez l’homme (Löffler et al, 2010) et les lésions provoquée par des souches PVL+ chez le lapin sont donc potentiellement plus proches de celles observées en pathologie humaine que celle qu’il est possible d’obtenir chez la souris. Des modèles de sepsis (Diep et al, 2008), d’infection osseuse (Crémieux et al, 2009) et de pneumonie (Diep et al, 2010) ont donc été mis au point avec cette espèce.

Les résultats obtenus par Diep et al dans leur modèle de sepsis en 2008 ne montraient qu’un effet modeste et transitoire de la PVL après inoculation intraveineuse. Les souches cliniques de SARM-C PVL+ comparés à leurs dérivés isogéniques PVL- étaient associées à une capacité de colonisation plus importante des reins après inoculation, attestée par un nombre plus important de bactéries retrouvé à ce niveau. Par contre, la colonisation du foie, de la rate et des poumons était comparable et le nombre plus élevé de bactérie au niveau rénal ne semblait pas avoir de conséquence (Diep et al, 2008). Les auteurs concluaient donc à un rôle plutôt marginal de la PVL dans la pathogénie des infections à SARM-C aux USA. Cependant, même si les bactériémies représentent près de 65% des infections à SARM-C rapportées aux USA (Klevens et al, 2007), il s’agit le plus souvent de bactériémies secondaires à un foyer d’infection staphylococcique qu’il soit cutané, osseux ou pulmonaire. La présence de ces foyers initiaux, volontiers nécrotiques, est associée à un innoculum élevé et à la production de quantités importantes de PVL. Le modèle choisi avec inoculation intraveineuse directe ne

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reproduit donc qu’imparfaitement la pathologie humaine. De plus, contrairement à ce que nous avons pu montrer dans les pneumonies et qui a été démontré également pour les infections ostéo-articulaires, la présence de la PVL ne semble pas associée cliniquement à une gravité particulière en cas de bactériémie. Ainsi, à partir d’un échantillon de 1350 souches de SARM, Tattevin et al n’ont montré aucune différence en termes de durée de séjour ou de mortalité entre les souches PVL+ (en majorité USA300) et des souches PVL négatives (Tattevin et al, 2012).

Le modèle d’infection respiratoire proposé par la même équipe est beaucoup plus convaincant quant au rôle de la PVL en tant que facteur de virulence. En effet, après confirmation de la sensibilité des PNN de lapin à la PVL, Diep et al ont été capables, après instillation d’un inoculum 10 fois moins élevé que celui utilisé dans les modèles murins, de reproduire les lésions nécrotique et hémorragiques pulmonaires observées chez l’homme (Diep et al, 2010). La comparaison dans ce modèle entre des souches LAC dérivées de souches clinique de SARM-C USA300 et leurs homologues LACΔpvl a montré une mortalité plus importante avec les souches PVL+ ainsi qu’une production plus importante de cytokines pro-inflammatoires, en particulier l’interleukine 8. De plus, la présence de PVL a été associée à un œdème pulmonaire important et à une augmentation nette du taux de protéines dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire. Ces dernières constatations sont à rapprocher de l’observation fréquente, dans les pneumonies nécrosantes humaines, d’un phénomène d’œdème pulmonaire lésionnel, riche en protéine, se traduisant par le tableau clinique de syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA). Ainsi, un SDRA était présent chez 43,6% de nos patients dans la dernière étude. Enfin, les travaux de Diep et al ont confirmé le rôle central joué par les polynucléaires dans la pathogénie des pneumonies nécrosantes en montrant que l’instillation de PVL à forte concentration ne provoquait chez des lapins neutropéniques ni augmentation d’IL-8, ni œdème pulmonaire ni lésions de nécrose hémorragique. Chez les lapins non neutropéniques, par contre, l’instillation de PVL reproduit les lésions observées après instillation de la souche sauvage LAC PVL+. L’ensemble de ces constatations montre que ce modèle d’infection chez le lapin est probablement celui qui est le plus proche de l’infection humaine et a conduit les auteurs à proposer un modèle physiopathologique rendant compte de l’effet de la PVL chez l’homme. Ce modèle est résumé par la figure 19 et se décline de la façon suivante : lorsqu’une souche de S aureus PVL + atteint les alvéoles pulmonaires après inhalation, elle est probablement éliminée sauf

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si les conditions locales sont propices à l’obtention de fortes concentrations de bactéries. Il est suggéré que la grippe puisse être un des facteurs susceptibles d’aboutir à ces fortes concentrations de S. aureus au sein du tissu pulmonaire. Lorsque la concentration bactérienne est élevée, la PVL est produite en quantité suffisamment importante pour activer les PNN et les macrophages alvéolaires et ainsi induire la production de médiateurs de l’inflammation. Ces médiateurs induisent le recrutement d’un nombre important de PNN qui, sous l’effet de la PVL, vont à leur tour être activés et lysés, provoquant la libération de protéases et de radicaux oxydants. Ces composés toxiques vont entrainer un œdème pulmonaire et des lésions cellulaires aboutissant à la nécrose hémorragique qui, associée à l’œdème pulmonaire, est responsable de l’hypoxie et de l’insuffisance respiratoire conduisant au décès (Diep et al, 2010).

Figure 19 : Représentation des effets de la PVL au niveau alvéolaire. La présence de PVL induit l’activation des

PNN et des macrophages et le recrutement des PNN via la production de cytokines. La dégranulation des PNN induite par la PVL provoque d’intenses lésions cellulaires et un œdème important. Les flèches noires représentent les mécanismes prouvés, les flèches grises les mécanismes hypothétiques. D’après Diep et al (Diep et al, 2010)

2. Données chez l’homme

Evoquée par Panton et Valentine dès 1932, La toxicité de la PVL sur les polynucléaires humains a été confirmée par de nombreux travaux récents (Hongo et al, 2009 ; Hermos et al, 2010 ; Löffler et al 2010 ; Niemann et al, 2012). Pourtant, certains auteurs n’ont pu observer

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de leucotoxicité liée à la PVL dans un modèle d’interaction PNN humains-PVL dans lequel les PNN étaient exposés au surnageant de cultures de souches cliniques USA300 LAC (Voyich et al, 2006). Les auteurs concluaient à l’absence de rôle significatif pour la PVL en pathologie humaine et ces conclusions ont pour partie été responsables de la controverse autour du rôle pathogène de la PVL. En utilisant un modèle similaire et les mêmes souches, Beyssere des horts et al sont arrivés à des conclusions diamétralement opposées en montrant une toxicité marquée de la PVL produite par les souches USA300 (Besseyre des Horts et al, 2010). L’explication de ces résultats discordants résiderait dans l’utilisation par l’équipe de Voyich et al de surnageants préalablement congelés, la congélation ayant entrainé la perte de l’activité leucotoxique. Plus récemment, le rôle central joué par la PVL dans les infections respiratoires humaines a été confirmé par des données expérimentales mettant en évidence les liens entre les macrophages alvéolaires, les cellules épithéliales respiratoires et la PVL. Ainsi, Perret et al ont comparé les effets d’un large panel de toxines staphylococciques recombinantes (Hémolysines alpha, béta, delta et gamma, Phenol Soluble Modulin α 1 et 3, LukDE et PVL) sur la réponse inflammatoire de macrophages alvéolaires humains. Les auteurs de ce travail ont montré que l’exposition à l’hémolysine gamma de type BC (pour mémoire, l’hémolysine gamma comprend le type BA et le type BC dont les propriétés ne sont pas strictement superposables), et surtout à la PVL induisait une réponse inflammatoire intense se traduisant par une sécrétion importante d’interleukine 1β (IL-1β). Cette sécrétion est sous la dépendance de l’activation d’un système inné de transmission du signal inflammatoire : l’inflamasome. L’activation de l’inflamasome débute à de très faibles concentrations (de l’ordre du nanomole) et est dose-dépendante pour l’hémolysine gamma et la PVL. Une sécrétion d’IL-1β est également observée lors de l’exposition à de faibles concentrations d’hémolysine δ mais dans ce cas, la production d’IL-1β atteint rapidement un plateau (Perret et al, 2012). Lors de l’utilisation dans le même travail de souches cliniques délétées du gène correspondant, les auteurs ont montré que l’induction d’IL-1β était là encore plus marquée avec la PVL qu’avec les autres toxines étudiées (Perret et al 2012). Enfin, l’utilisation de cultures cellulaires mixtes associant macrophages alvéolaires et cellules épithéliales respiratoires a permis de montrer que la sécrétion d’IL-1β par les macrophages induisait une production d’IL-8 et de MCP-1 directement par les cellules épithéliales, cette production in situ de cytokines étant susceptibles d’amplifier de façon importante la réponse inflammatoire (Perret et al, 2012).

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Lorsque l’on s’intéresse aux données cliniques, le rôle pathogène potentiel de la PVL est là encore âprement discuté. En effet, la PVL en tant que facteur de gravité a été testée dans plusieurs études réalisées principalement aux USA. En 2011, Peyrani et al ont montré dans une étude portant sur 107 patients présentant une pneumonie nosocomiale, une mortalité identique entre les souches PVL+ (29 cas) et les souches PVL- (78 cas) (Peyrani et al, 2011). Cependant, bien que les souches PVL+ observées dans cette étude aient été des souches d’origine « communautaire » au sens de la lignée bactérienne, il s’agissait de pneumonies authentiquement nosocomiales, le plus souvent acquises sous ventilation mécanique. Dans ce contexte, il est vraisemblable que le rôle des facteurs de virulence bactériens soit moins prééminent par rapport aux facteurs liés à l’hôte. Dans une autre étude portant uniquement sur les infections à SARM réalisée à Chicago, Hota et al ont montré que, malgré une augmentation importante du nombre d’infections dues à la souche USA 300, cette dernière était associée à une mortalité globale significativement moindre comparé à d’autres souches de SARM et que la présence de la PVL n’était pas associée à une sévérité particulière. Dans la même étude, l’existence d’une pneumonie due à USA 300 était par contre associée à une multiplication par 30 du risque de décès (Hota et al, 2011). Cette apparente discordance illustre un phénomène que nous avons déjà évoqué : dans les études portant sur toutes les pathologies dues aux souches PVL +, la présence de la PVL est habituellement associée à une augmentation importante du nombre d’infections de la peau et des tissus mous, ces dernières étant en outre aisément documentées du fait de la présence de pus facilement accessible aux prélèvements bactériologiques. Or, cette surreprésentation des infections de la peau tend à diminuer la sévérité globale des infections à S. aureus PVL+ d’autant que les infections à SARM PVL- sont plus souvent des infections profondes. Cet effet « masquant » des infections cutanées peut aller jusqu’à annuler complètement la gravité des infections profondes comme les pneumonies car ces dernières sont beaucoup plus rares. L’étude des liens entre la présence de PVL et la sévérité ne doit donc pas ce concevoir de façon globale mais uniquement dans le cadre d’une définition stricte de la pathologie étudiée.

Malheureusement, cette difficulté n’est pas toujours prise en compte et peut aboutir à des conclusions probablement erronées. Ainsi, Shallcross et al ont publié récemment une méta-analyse compilant les résultats de 7 études de pneumonies staphylococciques chez l’homme dont la conclusion principale était que la présence de la PVL n’était associée à aucune gravité particulière en cas de pneumonie staphylococcique (Shallcross et al, 2012). Cette

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affirmation, reprise dans un éditorial dans la même revue (Day, 2012) s’appuyait en outre sur l’absence de lien retrouvé dans certains modèles murins de pneumonie sans tenir compte des données observées chez le lapin. Pourtant, les conclusions de cette méta-analyse ne résistent pas à l’étude approfondie des travaux cités. Ainsi, pour une des études réalisée à Singapour comportant 30 cas de pneumonies (Hsu et al, 2004), la mortalité par pneumonie PVL +, qui était de 100% (1cas/1…) a été confondue avec la mortalité globale des infections PVL+ quelles qu’elles soient (1/19 vs 3/76 PVL-). De même, l’étude de Peyrani et al que nous avons évoquée précédemment a été incluse dans l’analyse alors qu’il s’agissait de