Dll1 et Holoprosencéphalie

Récemment,  l’équipe a émis l’hypothèse qu’une diminution de l’activité de la voie Notch  au  cours  du  développement  du  cerveau  pourrait  potentialiser  l’apparition de l’Holoprosencéphalie. 

En  effet,  le  gène  Dll1  codant  pour  un  ligand  des  récepteurs  Notch  a  été  associé  à  l’Holoprosencéphalie chez plusieurs patients. Ce gène est délété à l’état hétérozygote chez 4  patients présentant un phénotype d’Holoprosencéphalie (2 formes alobaires,  1  forme  semilobaire et 1 microforme chez 2 frères). Cependant, cette délétion dans la région 6qter,  comporte de nombreux autres gènes. La plus petite région délétée (2,2 MB) comprend 14  gènes. C’est donc par  hiérarchisation  bioinformatique  dans  un  premier  temps  que  notre  équipe  a  identifié  DLL1  comme  le  meilleur  gène  candidat  (Aerts  et  al.,  2006). L’étude moléculaire du gène DLL1 par séquençage a ensuite été mise au point et une série de 100  proposants a été analysée. Une délétion de 3 nucléotides a été identifiée concernant deux  codons impliqués dans le domaine d’ubiquitination. D’autre part, l’expression  de  Dll1  est  compatible avec un rôle au cours du développement précoce du cerveau antérieur. 

Par ailleurs, les mutants hétérozygotes pour Dll1 présentent des anomalies de la ligne  médiane mais pas de réel phénotype HPE (Przemeck et al., 2003). Cependant, il n’existe pas à ce jour d’études approfondies des structures cérébrales chez ces embryons qui présentent  une  létalité  embryonnaire  précoce  (E11).  Des  inactivations  conditionnelles  et  des  surexpressions  de  Dll1  dans  le  télencéphale  ont  pu  mettre  en  évidence  un  rôle  dose­ dépendant  dans  la  neurogenèse  de  la  zone  ventriculaire  (Kawaguchi  et  al.,  2008).  Cela  conforte le rôle important de Dll1 au cours du développement du cerveau mais à des stades  plus tardifs que ceux impliqués dans l’HPE. 

Les études d’invalidation des principaux acteurs de la voie Notch ont mis en évidence son caractère indispensable dans la différenciation et le développement des tissus comme le  système nerveux central. 

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OBJECTIFS DE LA THESE 

Mon travail de thèse s’est inscrit dans le projet de recherche de l’équipe « Génétique  des Pathologies Liées au Développement » au sein de l’unité CNRS­UMR6290. Le travail mis  en  place  sur  la  thématique  de  l’HPE  a  débuté  en  1996  et a pour objectif d’améliorer les connaissances cliniques, moléculaires et physiologiques inhérentes à cette pathologie. Dans  ce but, des études sont réalisées sur des cohortes de patients permettant d’identifier des mécanismes  moléculaires  impliqués  qui  seront  également  analysés  grâce  à  de  modèles  animaux.  Ces  deux  approches  sont  totalement  complémentaires  et  ont  été  incluses  dans  mon travail de thèse. Cela m’a permis d’avoir une vision globale des processus perturbés au cours de l’apparition de l’HPE. 

 Validation de l’implication de la voie de signalisation Notch dans l’Holoprosencéphalie   

Il est ressorti des travaux préalables réalisés par l’équipe que la voie de signalisation  Notch pourrait jouer un rôle dans l’apparition d’une anomalie de type HPE. L’un des objectifs  de  ma  thèse  a  donc  été  de  caractériser l’expression des  composants  de  la  voie  Notch  au  cours du développement du cerveau antérieur en conditions normales de développement.  

Pour cela j’ai utilisé le modèle d’embryon de poulet. J’ai ainsi pu décrire une activité de la voie Notch spécifiquement restreinte au niveau de l’hypothalamus. Par la suite, j’ai mis en  place  une  technique  originale  de  culture  d’embryons pour réaliser  des  inhibitions  pharmacologiques.   Cette  approche  combinée  à  une  analyse  transcriptomique  m’a  permis  d’étudier les répercussions d’une inactivation de la voie Notch au cours du développement  de l’hypothalamus. Notre étude a permis d’identifier de nouvelles cibles de la voie Notch, tels  que  Tagln3,  Chga  ou  Chrdl1  au  niveau  de  différents  territoires  neurogéniques,  en  particulier au niveau de ceux de l’hypothalamus. 

La  neurogenèse  au  niveau  de  ce  territoire  est  encore  mal  définie  et  bien  que  certaines études y associent la voie Notch, aucune ne fait part de son mode d’action.   

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Par ailleurs,  l’étude d’expression de Shh, gène majeur de l’HPE, chez des embryons déficients pour la voie Notch, m’a permis de montrer que cette voie contribuait à la régulation de ce gène. Pour la première fois cette étude fonctionnelle permet le lien entre  l’HPE et la voie Notch.  

 Le modèle multi­hit pour l’Holoprosencéphalie : Etude clinique chez l’homme puis

moléculaire chez l’embryon de poulet 

Dans l’hypothèse multi­hit pour l’Holoprosencéphalie,  il  a  été  mis  en  avant  que  différents facteurs, d’origine génétique ou environnementale, pourraient retentir sur une ou  plusieurs  voies  de  signalisation  et  en  entraîner  la  dérégulation.  La  modification  des  interactions entre ces voies de signalisation qui s’en suit, va agir au niveau spatio­temporel  sur la mise en place du cerveau antérieur. De plus, le caractère dose­dépendant entre les  différents  acteurs  des  voies  de  signalisation  corrèle  avec  la  diversité  des  phénotypes  observés dans l’HPE. 

Afin de consolider le modèle multi­hit, nous avons choisi dans un premier temps de  regrouper les données cliniques et moléculaires des patients porteurs d’une HPE. Les données  ont  été  entrées  dans  une  base  de  données  dédiée,  accessible  en  ligne.  Sandra  Mercier  a  ensuite  réalisé  des  recherches  de  corrélations  génotype­phénotype.  Ce  travail  avait  pour  but  de  conforter  le  modèle  multi­hit chez l’Homme en  dégageant  des  signes  cliniques caractéristiques d’une voie de signalisation.  Par  ailleurs,  Sandra  Mercier  a  pu  définir un algorithme diagnostique afin de préciser le conseil génétique. 

Dans  un deuxième  temps,  nous  avons  choisi  de  valider  ce  modèle  multi­hit  en  utilisant  un modèle animal, l’embryon de poulet. Pour cela, deux voies majeures de l’Holoprosencéphalie, les voies Nodal et Shh, ont été testées. 

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RÉSULTATS