Dispositifs d’échantillonnage

Deux techniques d’échantillonnage des biofilms ont été utilisées au cours de cette étude. La première met en jeu des substrats artificiels. Il s’agit de la technique qui a été la plus utilisée dans les différents volets. L’utilisation de ces substrats artificiels a été validée par comparaison à la deuxième technique d’échantillonnage, qui consistait à prélever directement les biofilms présents sur les substrats naturels des cours d’eau.

3.2.1 Substrats artificiels

L’essentiel des prélèvements ont été effectués sur des substrats artificiels (Figure 17).

Il s'agit de lames de verre placées, chacune, dans un tube de polypropylène ouvert à ses deux extrémités. Cette disposition permet tout à la fois, le passage de l’eau, la colonisation de la lame et le développement du biofilm en milieu "ouvert". Elle présente l'avantage de ne pas mener à la formation de chemins préférentiels de circulation de l'eau et à la genèse de zones anaérobies.

L’utilisation de ces tubes comme support des lames peut toutefois être à l’origine d’artéfacts. Ils peuvent, en effet, jouer un rôle de protection du biofilm, en modifiant l’hydrodynamique de l’eau sur celui-ci, en diminuant par exemple l'importance des forces de cisaillement. De plus, lorsque de gros débris (fragments de branches, feuilles…) sont transportés par les cours d'eau, l'extrémité amont des tubes peut être obturée, limitant ainsi le passage de l'eau. L'orientation des tubes par rapport aux lignes de courant peut également changer au cours de l'incubation. Une orientation perpendiculaire aux lignes de courant amoindrit l’effet des changements de débits sur le biofilm. De plus, en raison de la nécessité de les fixer à la rive, les tubes sont souvent entrainés peu à peu vers la rive où ils sont alors abrités dans des zones hydrodynamiquement plus calmes. Dans ces zones, l’augmentation la vitesse de l’eau n’est d'ailleurs pas toujours proportionnelle à l’augmentation du débit dans la veine centrale.

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Les lames utilisées sont des lames de microscopie dont la taille est de : 26 x 76 mm, soit une surface de colonisation de 3952 mm² par lame. A chaque campagne, des lames neuves sont utilisées. Les tubes sont attachés par 3 à l’aide de fil de pêche de 0.50 mm de diamètre (résistance : 3.90 kg). Pour la station Aquarium, le fil de pêche est remplacé par un fil d’acier tressé entouré d’une gaine de nylon (résistance 41 kg). Pour la station Liège, ce dispositif n’étant pas encore assez résistant, nous avons remplacé ces fils par des anneaux métalliques (Figure 18).

Deux groupes de 3 tubes sont attachés sur la rive de chacune des stations (à la végétation si cela est possible ou à un crochet dans les stations souterraines) avec de la cordelette d’escalade. L’accrochage des groupes de tubes à la cordelette s’effectue grâce à des émerillons. Pour les stations Liège et Aquarium, les contraintes physiques nous ont amenés à utiliser une cordelette de plus gros diamètre et à la protéger avec un tube en plastique. Pour qu'ils restent immergés, les groupes de tubes sont lestés par un plomb de pêche de 50 g.

Ces dispositifs étaient mis en incubation dans les cours d’eau pour une durée de 15 jours (dans le cas des volets "bassin versant" et "réseau aixois" de l'étude). Le choix de cette durée a été fait en fonction des résultats de tests préliminaires : la durée d’incubation des substrats devait être suffisamment longue pour permettre aux biofilms de se développer et d’atteindre un état proche de la maturité. A l'inverse, elle ne devait pas trop longue afin de réduire la probabilité de changements importants des conditions météorologiques au cours d’une même période d'incubation mais aussi afin de limiter les risques de dégradations (d’origine naturelle ou humaine) et de vol des dispositifs.

Figure 17: dispositif d'échantillonnage de biofilm par la technique des substrats artificiels.

Figure 18: Améliorations apportées au dispositif d’échantillonnage pour les stations Aquarium (à gauche) et Liège (à droite).

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Le choix de l’utilisation du verre, comme substrat artificiel, a été effectué en fonction des données bibliographiques. En effet, le verre permet un développement de biofilm à l’image des

biofilms présents naturellement dans les cours d’eau, sans toutefois favoriser la présence de Lpn

(Rogers, et al., 1994). Nous souhaitons, en effet, donner une image la plus juste de la présence de

Lpn dans les biofilms de cours d’eau. De plus, l’absence de microporosité permet un bon

décrochement du biofilm lors de l’étape de grattage du substrat et une meilleure évaluation de la surface de développement du biofilm que l’utilisation d’un galet. Enfin, l’utilisation du verre nous permet de rester dans la continuité de précédentes études effectuées au sein du laboratoire.

Malgré les inconvénients évoqués plus haut, le choix a été fait de disposer les tubes contenant les substrats artificiels à proximité des rives et non pas dans la veine centrale, essentiellement en raison des risques de perte par arrachage lors de gros débits, mais également pour des raisons pratiques vis-à-vis de la mise en place et du retrait des tubes.

Une fois récupérés, les biofilms, ramenés au laboratoire, étaient remis en suspension par grattage des lames de verre dans de l’eau du cours d’eau de la station correspondante, préalablement stérilisée par filtration sur filtre en fibre de verre de porosité 0.2 µm.

3.2.2 Substrats Naturels

Les biofilms développés sur les substrats naturels ont également été échantillonnées à trois reprises dans les stations du bassin versant du lac (Figure 19).

Chacun des dispositifs mis en œuvre a nécessité l'intervention de deux opérateurs.

Dans chacune des stations aériennes, un galet, où tout autre substrat de taille suffisante, était extrait du cours d’eau, puis placé sur le dispositif d’échantillonnage. Le système de grattage était ensuite fixé sur une zone suffisamment plane du galet.

Le système de grattage du biofilm est constitué des éléments suivants :

• une brosse en plastique dont la rotation est entraînée par une visseuse électrique réglée sur

une vitesse de l'ordre de 80 t.min-1.

• un cylindre en PVC de 32 mm de diamètre dans lequel se trouve la brosse, et d'où émerge la

tige de fixation à la visseuse. L’extrémité du cylindre en contact avec le substrat est munie d'un joint (de diamètre interne 28 mm) afin de réaliser une étanchéité entre le substrat et le réservoir que constitue l’intérieur du cylindre. Le dispositif permet de gratter une surface de substrat bien définie, de 572.56 mm².

• un réseau de tubes grâce auxquels une circulation est établie entre le cylindre précédent et

un pilulier contenant 50 ml d’eau déminéralisée stérile. La circulation d’eau est réalisée à l’aide d’une pompe péristaltique à main (pompe WAB) : l’eau du pilulier passe dans la pompe, puis est envoyée au niveau du cylindre de PVC où elle se charge de fragments de biofilms avant de retourner dans le pilulier. Malgré la présence d’un joint entre le substrat et le tube PVC, des pertes de suspensions de biofilms sont parfois observées principalement en raison des irrégularités de la surface du support naturel choisi. C'est la raison pour laquelle le volume final de suspension de biofilm récupérée dans le pilulier est mesuré exactement lors du retour au laboratoire.

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Figure 19: Dispositif d'échantillonnage des substrats naturels (à droite: visualisation du biofilm par différence avec la zone échantillonnée). Les flèches représentent le sens de circulation de l’eau entre le pilulier et la

zone du substrat échantillonnée.

Le dispositif d’échantillonnage précédent n’est pas adapté pour les prélèvements effectués sur les parois des buses en béton comme celle de la station Aquarium. Dans ces cas, un autre dispositif a été utilisé, constitué des éléments suivants (Figure 20) :

- un tube en plastique ouvert à une seule extrémité dans le fond duquel est insérée une

brosse métallique,

- une pompe à vide à main,

- une seringue

- un flacon en polypropylène stérile

L’extrémité ouverte du tube en plastique était maintenue manuellement plaquée contre la surface immergée à échantillonner, un joint permettant d’assurer l’étanchéité entre le tube et l’eau environnante. Le substrat était gratté manuellement, là encore, sur toute la surface définie par le diamètre intérieur du tube, à l’aide de la brossette métallique. L’eau chargée du biofilm en suspension était ensuite aspirée dans le flacon à l'aide de la pompe à vide. Si nécessaire de l’eau peut être ajoutée à l’aide de la seringue, afin de renouveler le processus de grattage et de lavage. Le volume final de la suspension de biofilm était mesuré précisément lors du retour au laboratoire.

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Figure 20: Dispositif de prélèvements des substrats naturels utilisé lors de la campagne de mai 2008 et mis en œuvre également à la station Aquarium.

Comme cela est visible sur la Figure 19, les dispositifs d’échantillonnage permettent de prélever efficacement le biofilm des substrats naturels. Nous faisons donc l’hypothèse que la quasi-totalité du biofilm est récupéré lors du brossage du substrat, même en présence d’irrégularités à la surface du substrat.