Concentration de "Pseudomonas cultivables et des bactéries apparentées"

Les prélèvements effectués sur le réseau aixois ont également fait l'objet de dénombrements

de la forme cultivable de P.aeruginosa sur la base d'une culture sur milieu au cétrimide et à l’acide

nalidixique. Aucune vérification complémentaire de la présence effective de P. aeruginosa parmi les

colonies apparues sur les boite de Pétri (par des cribles biochimiques ou moléculaires) n'a été faite. Comme dans le cas de la technique FISH, les dénombrements effectués doivent donc être considérés comme ceux des formes cultivables de bactéries du genre Pseudomonas et de bactéries apparentées. Nous utiliserons donc une formule équivalente pour les désigner dans la suite du manuscrit.

Un volume de 200 µl des plus petites dilutions (0, 10-1 et 10-2) est ensemencé directement sur

une gélose au cétrimide et à l’acide nalidixique (Tableau 9) avant d’être placé à l’étuve à 42°C pendant 48 h. L’incubation à 42°C améliore la spécificité du milieu (Brown & Lowbury, 1965).

Tableau 9 : Composition du milieu de culture utilisé pour le dénombrement des "Pseudomonascultivables et

bactéries apparentées" Concentration (g/l) Peptone de gélatine 16.0 Hydrolysat de caséine 10.0 Sulfate de potassium 10.0 Chlorure de magnésium 1.4 Agar 11.0 pH = 7.1 ±0.2

Sélectivité du milieu pour P. aeruginosa

Cétrimide 0.2

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Les colonies se développant sur les boîtes sont ensuite dénombrées. La concentration de "Pseudomonascultivables et bactéries apparentées" est alors déterminée à partir de la formule suivante :

𝑃.𝑎𝑒𝑟𝑐𝑢𝑙𝑡=_𝑉𝑒^𝑋𝑐_𝑥^𝑥_𝑑^𝑉𝑠_𝑥𝑆𝑏

Avec : P.aer cult = concentration de Pseudomonascultivables et bactéries apparentées

(UFC/mm² de biofilm) Xc = Nombre de colonies

Vs = volume de suspension de biofilm après grattage (ml) Ve = Volume ensemencé (ml)

d = Facteur de dilution

Sb = Surface de biofilm échantillonnée (mm²) 3.4.1.8 Concentration en Lpn déterminée par Q-PCR

Sur les échantillons provenant du bassin versant (volet I), la concentration de Lpn est aussi

déterminée par la technique de PCR quantitative (PCR en temps réel) grâce au GenExtract (Figure 23) et au GeneDisc Cycler (GeneSystem®). Pour cela 1 ml de suspension de biofilm est placé dans un tube Eppendorf puis conservé à -18°C jusqu’à l’extraction. La conservation peut durer de quelques jours à quelques semaines.

Pour l’extraction, 1 ml de suspension de biofilm est placé dans un tube contenant le tampon de lyse (pack eaux sales). Les tubes sont placés dans un bac à ultrason pendant 20 min (250W, 40 kHz) puis au bain marie (150°C) pendant 10 minutes.

Le contenu des tubes est ensuite versé sur des colonnes de filtration permettant d’éliminer les gros débris. Le filtrat obtenu est ensuite centrifugé pendant 4 min à 2500 g. Le surnageant est alors mélangé à 2 ml de tampon de liaison et à 2 ml d’éthanol absolu et vortexé pendant 30 sec.

Puis le contenu des tubes est versé sur des colonnes de silice dont le rôle est de retenir l’ADN. Les colonnes sont lavées à l’aide de 2 et 4 ml de chacun des tampons de lavage, puis séchées pendant 20 minutes.

Les extraits d’ADN sont ensuite récupérés à l’aide de tampon d’élution préchauffé à 70°C. L’extrait recueilli (~200 µl) est transféré dans un tube Eppendorf et placé à -18°C jusqu’à l’amplification.

Figure 23 : GeneExtract équipé des cylindres de filtration.

L’amplification s’effectue à l’aide de GeneDisc et du GeneDiscCycler (Figure 24). Les puits du GeneDisc contiennent une fine galette contenant l’enzyme, les amorces ainsi que les nucléotides.

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Figure 24: GeneDisc vu de dessus (à gauche) et GeneDisc cycler (à droite). Le disque possède 6 secteurs analytiques :

• les 5 premiers reçoivent les extraits des différents échantillons,

• le 6ème secteur est un contrôle négatif : l’extrait inséré correspond au témoin

d’extraction.

Chaque secteur comprend 6 puits contenant chacun les primers spécifiques à la détection de

Lpn ainsi que la sonde fluorescente permettant la quantification de l’ADN

(FAM[6-carbofluorescein]-TAMRA[6-caboxytetramethylrhodamine]) :

• les 2 premiers puits sont des contrôles positifs : ils servent à la détection d’inhibiteurs

internes à l’échantillon. Ils contiennent en plus, une séquence synthétique d’ADN dont chaque extrémité présente la séquence spécifique aux amorces utilisées.

• 3 autres puits permettent la détection et la quantification de Lpn.

• le dernier puits est un contrôle négatif de la PCR, ce puits ne possède pas d’amorces.

L’extrait d’ADN est mélangé à un « Mix » avant d’être placé dans un des secteurs au centre du GeneDisc, puis d’être réparti dans chacun des puits. La répartition dans les puits s’effectue par la formation puis la rupture d’un vide au niveau de la zone centrale du GeneDisc. De l’huile est également ajoutée dans chaque puits de la même manière.

Le disque est ensuite inséré dans le GeneDiscCycler et l’analyse peut être lancée. Le disque va tourner de manière régulière en passant successivement sur les 3 secteurs chauffant. Le disque effectue d’abord un cycle à 92°C afin d’activer l’enzyme dans chacun des puits, puis il effectuera 45 cycles sur chacun des 3 secteurs: 94°C ; 52°C puis 54°C, la taille des secteurs chauffants ainsi que la vitesse de rotation constante du disque permet de définir la durée correspondant à chacune des températures.

La concentration de Lpn est ensuite déterminée à partir des courbes d’évolution de la

fluorescence et du nombre de cycles à partir duquel on sort de la zone du bruit de fond (Ct). Ceci est effectué à l’aide d’une macro-commande développée par GeneSystem dans le logiciel Excel®.

La limite de détection en PCR est de 167 UG/L, tandis que la limite de quantification est

833 UG/L (Yaradou, et al., 2007). La limite de détection correspond au plus petit UG donnant un

résultat positif dans 90% des "runs", alors que la limite de quantification correspond au plus petit

123 3.4.1.9 Dénombrement des protistes

Les protistes ont été dénombrés à l’aide des techniques classiquement utilisées au laboratoire. 3.4.1.9.1 Flagellés

Un volume de 250 µl de suspension de biofilm est fixé avec 63 µl de glutaraldéhyde puis conservé à 4°C. Les flagellés sont ensuite marqués à la primuline avant filtration sur des filtres en polycarbonate noirs de 25 mm de diamètre et de porosité 0.8 µm (Osmonics). Les filtres sont ensuite montés entre lame et lamelle dans une goutte d’huile à immersion et conservés à -18°C jusqu’au comptage au microscope en épifluorescence (Nikon® Eclipse TE200) grâce au bloc de filtres B-2A

précédemment utilisés pour les dénombrements en immunofluorescence (Lpntotales). Lorsqu’ils sont

excités sous UV, les flagellés marqués à la primuline fluorescent d’un blanc bleuté. Cette fluorescence est maintenu lors d’une excitation dans le bleu, mais elle est masquée par la fluorescence de la chlorophylle a des flagellés autotrophes (fluorescence rouge). La différence de fluorescence permet de dénombrer à la fois les formes autotrophes et les formes hétérotrophes (Caron, 1983).

𝐹𝑙𝑎𝑔=_𝑆𝑐^𝑋𝑥_𝑥^𝑆𝑓_𝑉𝑓^𝑥_𝑥^𝑉𝑠_𝑆𝑏

Avec : Flag = nombre de flagellés par mm² de biofilm

X = Nombre moyen de flagellés par champ Sf = Surface de filtration (mm²)

Vs = volume de suspension de biofilm après grattage (ml) Sc = Surface du champ (mm²)

Vf = Volume filtré (ml)

Sb = Surface de biofilm échantillonnée (mm²) 3.4.1.9.2 Ciliés et amibes

Un volume de 1.25 ml de suspension de biofilm est fixé avec 420 µl d’HgCl saturé (40 mg.L-1) et

conservé à 4°C jusqu’au dénombrement. Jusqu’à 100 µl d’échantillon fixé sont placés dans une cuve d’Utermohl et mis à décanter pendant une nuit. Les ciliés et amibes sont ensuite dénombrés au

microscope inversé en lumière transmise (Nikon Eclipse TE200)(Sime-Ngando, et al., 1990). Le

dénombrement suit celle définie par Utermohl (1958).

La concentration en ciliés et en amibes est alors déterminée grâce à la formule suivante : 𝐶𝑖𝑙𝑖é𝑠,𝐴𝑚𝑖𝑏𝑒𝑠 =_𝑆𝑐^𝑋𝑥_𝑥^𝑆𝑓_𝑉𝑓^𝑥_𝑥^𝑉𝑠_𝑆𝑏

Avec : Ciliés, Amibes = nombre de ciliés ou d’amibes par mm² de biofilm

X = Nombre moyen de ciliés ou d’amibes par champ Sf = Surface de filtration (mm²)

Vs = volume de suspension de biofilm après grattage (ml) Sc = Surface du champ (mm²)

Vf = Volume filtré (ml)

124 3.4.2 Paramètres physico-chimiques

Les analyses physico-chimiques ont été effectuées soit sur les biofilms échantillonnés (poids sec et matière organique) soit sur des échantillons d’eau prélevés à chaque station au cours de la période d’incubation des biofilms (concentrations ioniques, COD, température, pH et conductivité). A cela s’ajoutent des mesures du débit du cours d’eau.

Les prélèvements d’eau sont effectués à l’aide d’un préleveur automatique (Isco ®). Le préleveur est placé successivement à chaque station pendant une durée de 24 heures. Il permet d’effectuer un prélèvement d’eau d’un même volume tous les ¼ d’heure. Le volume de chaque prélèvement varie en fonction de la station car il dépend de la différence de hauteur entre le préleveur et la rivière. Après 24 heures, 5 litres d’eau sont récupérés et placés à 4°C jusqu’au retour au laboratoire.

Le préleveur est alimenté grâce à une batterie (12V, 640A) qui doit être rechargée toutes les 48 h, c’est-à-dire toutes les 2 stations. Ceci va donc engendrer un décalage dans le temps des prélèvements à chaque station. Ce décalage peut atteindre 14 jours au maximum entre la première et la dernière station échantillonnée dans le cas du bassin versant. Mais le prélèvement est toujours effectué pendant la période de développement des biofilms.