Dispositif expérimental de l’étude à court terme

II.2.2.2 Tolérance des populations aux insecticides ...75

II.2.3 Dispositif expérimental de l’étude à long terme ...76

II.2.4 Mesure et analyse des traits d’histoire de vie ...78

II.2.4.1 Temps de développement des individus ...78

II.2.4.2 Taux de mortalité durant le développement ...79

II.2.4.3 Sex-ratio des populations...79

II.2.4.4 Fécondité et fertilité des individus ...79

II.2.4.5 Taille alaire des imagos ...79

II.2.4.6 Analyse statistique des traits d’histoire de vie ...80

II.2.5 Mesure et analyse de la tolérance des populations aux insecticides ...81

II.3 Résultats ...82

II.3.1 Concentration en polluants dans les milieux d’exposition ...82

II.3.2 Impact à court terme de l’exposition aux polluants sur les traits d’histoire de vie des populations ...84

II.3.2.1 Impact de l’ibuprofène ...84

II.3.2.2 Impact du benzo[a]pyrène ...87

II.3.2.3 Impact du bisphénol A ...91

II.3.2.4 Impact de l’ibuprofène, du bisphénol A et du benzo[a]pyrène en mélange ...91

II.3.3 Impact des polluants sur les traits d’histoire de vie des populations après 6 générations d’exposition ..94

II.3.3.1 Impact de l’ibuprofène ...94

II.3.3.2 Impact du benzo[a]pyrène ...97

II.3.3.3 Impact du bisphénol A ...97

Chapitre II : Effets des polluants sur les traits d’histoire de vie des populations 66

II.3.3.4 Impact de l’ibuprofène, du bisphénol A et du benzo[a]pyrène en mélange ... 101

II.3.3.5 Impact des polluants à court et long terme sur la tolérance aux insecticides ... 104

II.4 Discussion ... 105

II.4.1 Conséquences à court terme de l’exposition aux polluants sur le cycle de vie des individus ... 105

II.4.2 Conséquence de l’exposition multigénérationnelle aux polluants ... 109

II.4.3 Impact des polluants en mélange sur le développement des individus ... 111

II.4.4 Conséquences de la contamination des milieux sur la capacité vectorielle des individus ... 112

II.4.5 Conclusions ... 113

II.1 Objectifs de l’étude

Ce premier volet de la thèse visait à identifier les impacts de trois polluants communs des

eaux de surface, l’ibuprofène, le bisphénol A et le benzo[a]pyrène, sur les populations de de

moustique Aedes aegypti. Ce volet cherchait d’autre part à évaluer si la présence de ces trois polluants

en mélange dans le milieu modifiait les effets constatés sur les populations lors des expositions

individuelles. Outre les impacts de ces environnement pollués à court terme, c’est-à-dire sur la

première génération exposée, cette étude avait également pour objectif d’identifier quels pouvaient

être les impacts de ces pollutions lorsque les populations y étaient soumises durant plusieurs

générations successives.

De manière à révéler des modifications pouvant avoir des conséquences directes sur la

dynamique des populations, les traits d’histoire de vie des populations exposées aux polluants ont

été étudiés. Les traits permettant d’évaluer le potentiel de survie mais aussi de reproduction des

individus ont plus particulièrement été mesurés, à commencer par le temps de développement et

le taux de mortalité associé au développement des individus. Le sex-ratio, la taille des imagos

émergeant des milieux contaminés, leur fertilité et leur fécondité ont également été étudiés. La

capacité des individus au sein d’une population à se reproduire étant liée à leur capacité à engendrer

une descendance viable, le temps de développement, le taux de mortalité associé au développement

et le sex-ratio de la descendance des individus exposés aux polluants ont été mesurés. Ces mesures

sur la descendance ont été réalisées en milieu propre de manière à évaluer strictement la capacité

des individus exposés aux polluants à assurer leur descendance.

II.2 Démarche expérimentale et méthodologies adoptées

II.2.1 Conditions d’élevage en laboratoire

De manière à minimiser au mieux la variabilité entre les différentes expérimentations, les

conditions d’élevage des populations ont été standardisées tout au long des travaux de cette thèse,

que ce soit pour l’évaluation de l’impact des polluants étudiés à court terme et à long terme (Volet

1) mais aussi pour l’évaluation des mécanismes d’action de l’ibuprofène (Volet 2). Les

expérimentations ont été menées sur la souche de laboratoire d’Aedes aegypti « Liverpool », originaire

d’Afrique de l’ouest et introduite en laboratoire dans les années 1930 (Kuno, 2010). Cette souche

a servi de référence au séquençage du génome d’Aedes aegypti, et nous a été fournie par le Dr

Catherine Bourgoin de l’institut Pasteur de Paris. Les stades aquatiques (larves et nymphes) ont été

Chapitre II : Effets des polluants sur les traits d’histoire de vie des populations 68

élevés à une température de 29,5 °C (± 0.5), et soumis à un cycle artificiel jour/nuit de 16h/8h.

Dès la première heure suivant l’éclosion des larves et jusqu’à l’émergence des imagos, les individus

ont été élevés dans des cristallisoirs en verre à raison d’un individu par millilitre de milieu, et nourris

régulièrement au cours de leur développement avec des granulés de foin broyés, selon les quantités

indiquées dans le tableau II.1. Le milieu de base d’élevage des larves est simplement composé d’eau

du robinet de Grenoble. En effet, cela est possible car l’eau du réseau potable fournie par le

Syndicat Intercommunal des Eaux de la Région Grenobloise (SIERG) est captée directement dans

les nappes souterraines d’altitude où elle est naturellement filtrée. Elle ne nécessite ainsi aucun

traitement chimique préalable à la mise en circulation dans les réseaux de distribution. Les

paramètres physicochimiques de cette eau ne présentent pas de variations saisonnières ou

journalières (communication personnelle de la Régie des Eaux de Grenoble). Des analyses

chimiques contrôlant la présence de polluants métalliques ou organiques sont disponibles sur

demande auprès de la Régie des Eaux de Grenoble, et ne mettent pas en évidence de contamination

de cette eau. De manière à éviter le relargage de xénobiotiques dans les milieux d’élevage, ou au

contraire l’adsorption des polluants étudiés, nous avons évité au maximum le contact des milieux

d’élevage avec des éléments en plastique, et favorisé au maximum l’utilisation de contenants en

verre.

Tableau II.1 - Dose de nourriture apportée aux individus au cours de leur développement

Jour de culture 0 2 3 4 6 7 8 10

Dose de nourriture

(mg/ individu) ^{0,2 0,3 0,3 0,4 0,3 0,3 0,3 0,2}

Les imagos ont été placés dans des cages d’élevage (Bugdorm, MegaView Science Educational

Services Co, Taichung, Taiwan) moins de 12 heures après leur émergence. Les imagos ont été élevés

dans des conditions d’insectarium correspondant à une température de 28°C, un taux d’humidité à

80% ainsi qu’un cycle artificiel jour/nuit de 16h/8h. Un accès illimité à l’eau et à une solution de

sucrose 10 % a été permis aux imagos, leur fournissant les ressources énergétiques nécessaires au

maintien des fonctions de base. La maturation et la ponte des œufs ont été déclenchées chez les

femelles par la mise à disposition de repas de sang au moment voulu. Ces repas de sang ont été

effectués sur des souris, maintenues en stabulation dans une animâlerie agrée (n° B 38 421 10 001)

et manipulées en accord avec les normes européennes et les recommandations du comité d’éthique

chargé du dossier (ComEth Grenoble - C2EA - 12).

II.2.1.1 Exposition des populations aux polluants

Les impacts de l’ibuprofène, du bisphénol A et du benzo[a]pyrène seuls ou en mélange sur

les populations de moustiques Aedes aegypti ont été évalués à court ainsi qu’à long terme. Pour cela,

des populations d’individus ont été exposés aux polluants de manière chronique, à partir de l’heure

suivant l’éclosion des œufs, jusqu’à l’émergence des imagos. Chaque exposition a été effectuée dans

les conditions standardisées de densité, de température et d’alimentation présentées précédemment.

L’exposition chronique des individus aux polluants a été réalisée de manière

semi-dynamique, c’est-à-dire avec un remplacement du milieu par un milieu contaminé fraîchement

préparé toutes les 48 heures. Lors de chaque exposition aux polluants, une population témoin

provenant des mêmes lots d’œufs, exposée au solvant (éthanol), a été élevée en parallèle. Les

milieux témoins complémentés avec le solvant ont également été remplacés toutes les 48 heures.

Les concentrations de base d’exposition aux polluants ont été sélectionnées pour simuler

une pollution importante des milieux tout en conservant une cohérence vis-à-vis des doses

mesurées dans l’environnement (Tableau II.2, colonne x1). Pour le bisphénol A et l’ibuprofène, ces

concentrations de base ont servi de point d’origine à des gammes de concentration dix et cent fois

plus élevées (Tableau II.2, colonne x10 et x100). Dans le cas du benzo[a]pyrène, la gamme testée

comprend des concentrations deux et dix fois supérieures à la concentration de base (Tableau II.2,

colonne x2 et x10). Aucune concentration n’a été testée au-delà de 6 µg/l pour le benzo[a]pyrène

étant donné sa limite de solubilité dans l’eau pure à 25°C (3,8 µg/l). L’impact de ces polluants en

mélange a également été testé, en ajoutant au milieu les trois polluants étudiés à leur concentration

de base (Tableau II.2, mélange x1), ou à leur concentration x10 (Tableau II.2, mélange x10). Ainsi,

onze conditions d’exposition différentes ont été testées.

Tableau II.2 - Concentrations d'exposition aux polluants

concentrations de base x1 ^{x2 x10 x100} Ibuprofène 1 µg/l 10 µg/l 100 µg/l Bisphénol A 0,4 µg/l 4 µg/l 40 µg/l Benzo[a]pyrène 0,6 µg/l 1,2 µg/l 6 µg/l Mélange x1 Mélange x10

Chapitre II : Effets des polluants sur les traits d’histoire de vie des populations 70

II.2.1.2 Préparation des milieux pollués

L’ibuprofène (98% de pureté, CAS no. 15687-27-1), le bisphénol A (>99% de pureté, CAS

no. 80-05-7) et le benzo[a]pyrène (97% de pureté, CAN no. 50-32-8) ont été fournis par

Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Des solutions mères d’environ 10 mg/l ont été réalisées dans de

l’éthanol 96% (HPLC grade), aliquotées et stockées à l’obscurité à -20°C. Ces aliquotes ont servi à

la préparation des milieux polluées tout au long des travaux de cette thèse, de nouveaux aliquotes

étant utilisés à chaque préparation d’un nouveau milieu. Les milieux ont été préparés en ajoutant

les volumes adéquats de solutions mères des différents polluants à de l’eau du robinet. Les quantités

d’éthanol ont été ajustées dans chaque milieu pour atteindre 0,2 % d’éthanol final, dans les milieux

pollués et témoins.

II.2.1.3 Contrôle des concentrations de polluants présents dans les milieux au cours du temps

Les concentrations de polluants effectivement présentes dans les milieux, et leur évolution

au cours des 48 heures séparant deux changements de milieux ont été contrôlées. Pour cela, des

milieux contaminés par les plus faibles concentrations de polluants (concentrations x1) fraîchement

préparées ont été placés dans les mêmes contenants et les mêmes conditions de lumière et de

température que les populations exposées lors de nos expérimentations. Des échantillons de 500 ml

ont été prélevés après 0h, 24h et 48h de culture dans ces conditions (Figure II.1, partie gauches).

De façon à évaluer l’impact de la présence de larves sur les concentrations en polluants dans les

milieux contaminés, des milieux contenant une larve par millilitre ont été cultivés en parallèle, et

échantillonnés après 48h de culture (Figure II.1, partie droite). Les échantillons prélevés ont été

stockés à -20°C en attendant le dosage des polluants présents dans le milieu. Ces dosages ont été

effectués par Rovaltain research company (Alixan, France). L’ibuprofène a été extrait des milieux

par un procédé d’extraction à phase solide puis dosé par chromatographie liquide couplée à un

spectromètre de masse haute résolution (LC-HRMS/MS). Le bisphénol A et le benzo[a]pyrène ont

été extraits des milieux par « extraction par barreau aimanté absorbant », basée sur l’adsorption des

polluants sur un barreau aimanté absorbant Twister© (Gestel GmbH & Co. KG, Allemagne) puis

dosés en chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse (GC-MS/MS).

La variabilité de l’extraction et du dosage a été établie par l’extraction et le dosage de de 5 milieux

de contrôle formés avec des standards analytiques en parallèle des échantillons expérimentaux. La

justesse des dosages ainsi que la variabilité associée à l’extraction et au dosage sont présentés dans

le tableau II.3. Le dosage des échantillons a été effectué en duplicata, et la concentration établie

pour chaque milieu est basée sur la moyenne de ces deux mesures. L’évolution du pH et de la

conductivité au cours du temps a été mesurée dans ces milieux de manière à vérifier un impact

éventuel de l’ajout de polluants au milieu.

Tableau II.3 - Variabilité de l'extraction et du dosage des polluants étudiés dans les milieux de contrôle

établis avec les standards analytiques.

Ibuprofène Bisphénol A Benzo[a]pyrène

Concentration en standard analytique (µg/l) 1 0,5 0,5

Concentration moyenne mesurée (µg/l) ± 2x ecart-type 0,99 ± 0,07 0,52 ± 0,08 0,51 ± 0,16

Variation (% de déviation standard relative) 3,7 7,6 15,7

Figure II.1 - Dispositif expérimental d’échantillonnage pour la mesure des concentrations effectives de

polluants dans les milieux au cours du temps.

0 h 24 h 48 h Concentrations théoriques 1 µg/l 0,4 µg/l 0,6 µg/l 1 µg/l 0,4 µg/l 0,6 µg/l T em ps d ’éch an til lon nag e

Chapitre II : Effets des polluants sur les traits d’histoire de vie des populations 72

II.2.2 Dispositif expérimental de l’étude à court terme

II.2.2.1 Etude des traits d’histoire de vie des populations

L’évaluation de l’impact à court terme des polluants étudiés sur les populations de

moustiques Aedes aegypti a été effectuée séparément pour les quatre types de pollutions testées

(ibuprofène, bisphénol A, benzo[a]pyrène et mélange). Trois réplicats de populations de 100 larves

écloses dans l’heure ont été formés pour chaque condition de polluant et de concentration testée

(Figure II.2).

Expérimentation 1 Ibuprofène

Témoin _individus^x100 _individus^x100 _individus^x100

1 µg/l x100

individus individus^x100 individus^x100

10 µg/l x100

individus individus^x100 individus^x100

100 µg/l x100

individus individus^x100 individus^x100

Expérimentation 2 Bisphénol A

Témoin _individus^x100 _individus^x100 _individus^x100

0,4 µg/l x100

individus individus^x100 individus^x100

4 µg/l x100

individus individus^x100 individus^x100

40 µg/l x100

individus individus^x100 individus^x100

Expérimentation 3 Benzo[a]pyrène

Témoin _individus^x100 _individus^x100 _individus^x100

0,6 µg/l x100

individus individus^x100 individus^x100

6 µg/l x100

individus individus^x100 individus^x100

60 µg/l x100

individus individus^x100 individus^x100

Expérimentation 4 Mélange

Témoin _individus^x100 _individus^x100 _individus^x100 1 µg/l ibuprofène

0,4 µg/l bisphénol A 0,6 µg/l benzo[a]pyrène

x100

individus individus^x100 individus^x100

10 µg/l ibuprofène 4 µg/l bisphénol A 6 µg/l benzo[a]pyrène

x100

individus individus^x100 individus^x100

Figure II.2 - Dispositif expérimental de l'évaluation à court terme de l'impact des polluants sur les

populations.

Les traits d’histoire de vie de ces populations exposées ont été mesurés tout au long du

cycle de vie des individus de la population (Figure II.3 : encadré rouge). Les imagos émergés de ces

populations exposées ont été comptés, sexés et collectés précautionneusement toutes les 10 ou

14 h alternativement jusqu’à l’émergence de la totalité des individus des populations, permettant

ainsi de mesurer le temps de développement, le taux de mortalité associé au développement, la

taille des imagos et le sex-ratio des populations exposées (Figure II.3 : 1-2-4). La capacité à se

reproduire de ces imagos a également été évaluée par la mesure du nombre d’œufs pondus, du taux

d’éclosion des pontes produites et du nombre de larves engendrées (Figure II.3 : 6-7-8). Pour cela,

les imagos de chaque réplicat ont été placés dans des cages d’élevage différentes, permettant ainsi

des accouplements entre mâles et femelles d’un même réplicat. Quinze jours après le début de

l’expérimentation, un repas de sang a été mis à disposition des femelles durant 1h. Les femelles

non gorgées ont été retirées immédiatement après, ainsi que les coupelles d’eau afin d’éviter le

Accouplement Mâle Repas de sang Femelle Emergence Métamorphose Mue _{Mue Mue}

Eclosion

Ponte Femelle gorgée

Emergence Métamorphose Mue _{Mue Mue}

Eclosion

Population exposée Descendance – non exposée

① ②

③

⑤

⑥

⑧

⑨ ⑩

⑪

④

⑦

Développement des individus exposés ① - Temps de développement

② - Taux de mortalité associé au développement

④ - Sex-ratio

⑤ - Taille des imagos

Tolérance aux stress ③ - Tolérance aux insecticides

Potentiel reproductif des individus exposés ⑥ - Nombre d’œufs pondus

⑦ - Taux d’éclosion des pontes

⑧ - Nombre de descendance produite

⑨ - Temps de développement de la descendance

⑩ - Taux de mortalité associé au développement de la descendance

⑪ - Sex-ratio de la descendance

Traits mesurés

Figure II.3 - Suivi de l’impact de l’ibuprofène, du bisphénol A et du benzo[a]pyrène à court terme

Etude du cycle de vie des individus exposés aux polluants et de leur descendance non exposée.

Chapitre II : Effets des polluants sur les traits d’histoire de vie des populations 74

déclenchement de ponte dans la cage. Trois jours après le repas de sang, 10 femelles gorgées par

réplicat (c’est-à-dire 30 par condition) ont été isolées dans de petites boites de pétri tapissées de

papier-filtre humide servant de support de ponte. Les œufs ainsi pondus ont par la suite été comptés

de manière à évaluer la fertilité de chaque femelle individuellement (Figure II.3 : 6). Les papiers

couverts d’œufs de chaque femelle ainsi obtenus ont été individuellement submergés dans du milieu

d’éclosion de manière à provoquer une éclosion massive et rapide de plus de 95% des œufs féconds.

Pour évaluer la fécondité de chaque femelle, les papiers d’œufs ont été laissés dans le milieu

d’éclosion afin de comptabiliser d’éventuelles éclosions tardives, permettant ainsi de déterminer le

taux d’éclosion de chaque ponte ainsi que le nombre de descendants viables à l’éclosion (Figure

II.3 : 7 et 8). Après l’isolement des femelles pour les mesures de fertilité et fécondité, les imagos de

la génération parentale restants ont été collectés et conservés pour réaliser les mesures de taille

alaire afin d’estimer la taille des individus des différentes populations (Figure II.3 : 5), la taille des

imagos étant connue pour être directement corrélée à la longueur alaire des individus (Christophers,

1960; Clements, 1992). La taille des femelles étant également corrélée à l’abondance des pontes

(Christophers, 1960; Clements, 1992), les femelles isolées pour les mesures de fertilité et de

fécondité ont pour leur part été collectées après la ponte et conservées individuellement afin de

pouvoir établir la corrélation de la taille alaire de chaque femelle à l’abondance de leur ponte

respective, de manière à maitriser un facteur confondant potentiel.

En vue d’évaluer la viabilité et la qualité des descendances engendrées par les populations

exposées, les cycles de vie de ces descendances ont été étudiés en milieu non pollué

(Figure II.3 : encadré vert). Une heure après l’immersion des papiers de pontes individuels, les

larves écloses ont été comptées et les descendances de chaque femelle provenant d’un même

réplicat ont été regroupées en lots. Trois réplicats de 100 larves ont été isolés de chaque lot, formant

ainsi 9 réplicats de descendance pour chaque condition d’exposition testées. Les réplicats de 100

larves de la descendance ont été placés en milieu non pollué, dans les mêmes conditions standards

que la génération parentale. Comme chez les générations parentales, le temps de développement,

le taux de mortalité associé au développement et le sex-ratio des descendants ont été mesurés

(Figure II.3 : 9-10-11).

II.2.2.2 Tolérance des populations aux insecticides

L’impact de l’exposition aux plus faibles concentrations de polluants sur la tolérance des

individus au stress provoqué par deux insecticides utilisés dans le contrôle des populations de

moustiques a également été mesurée (Figure II.3 : 3). Cette étude a fait l’objet d’une

expérimentation indépendante. Deux insecticides aux modes d’actions très différents et

couramment utilisés comme larvicides dans le contrôle des populations de moustiques ont été

testés : le Bti (Bacillus turingiensis israelensis), une bactérie produisant un cristal protéique composé de

plusieurs toxines et le téméphos, un insecticide chimique de la classe des organophosphorés. Pour

cela, 1000 larves provenant du même lot d’œufs ont été exposées dès l’éclosion des œufs, au

solvant, à l’ibuprofène (1 µg/l), au bisphénol A (0,4 µg/l), au benzo[a]pyrène (0,6 µg/l) ou au

mélange des trois (Figure II.4 : partie haute).

Figure II.4 - Dispositif expérimental de l'étude de la tolérance aux insecticides des populations exposées

à court terme aux polluants.

Ibuprofène 1 µg/l ^{Bisphénol A}0,4 µg/l ^{Benzo[a]pyrène}0,6 µg/l Témoin Mélange Ibuprofène 1 µg/l Bisphénol A 0,4 µg/l Benzo[a]pyrène 0,6 µg/l X1000 individus

Court terme – milieux pollués

X1000 individus X1000 individus X1000 individus X1000 individus

Larves de stade 3 tardif Bioessai Bti – 4 réplicats x 5 doses

Chapitre II : Effets des polluants sur les traits d’histoire de vie des populations 76

Dans le document Conséquences de l'exposition de l'insecte modèle Aedes aegypti aux polluants des eaux de surface : Des mécanismes moléculaires à la dynamique des populations (Page 66-77)