Le diagnostic du botulisme est basé sur l'étude des signes cliniques et sur les éléments épidémiologiques. Le botulisme ne sera formellement confirmé que par des tests biologiques effectués dans des laboratoires spécialisés et dont la réalisation prend plusieurs jours.
Il existe deux principales catégories de tests permettant le diagnostic du botulisme : les
tests in vivo de létalité sur souris et les tests in vitro, principalement basés sur des techniques
biologiques, mais le sérum et les selles du patient sont prélevés en priorité. (Sobel, 2005; J.-C.
Zhang et al., 2010) La toxine botulique présente dans l'organisme pénétrant rapidement dans
les motoneurones, il est possible que la toxine ne soit plus détectable dans le sérum si le prélèvement est effectué tardivement. Il a été d'ailleurs été mis en évidence qu'un sérum prélevé deux jours après intoxication ne permet la détection des toxines botuliques que dans
13 % des cas. (Woodruff et al., 1992) Des échantillons de sang ou de liquide gastrique
peuvent aussi servir de base au diagnostic, surtout dans les cas où les tests effectués sur le sérum et les selles ne s'avèrent pas positifs. Dans le cas d'une suspicion d'intoxination alimentaire, les aliments suspects doivent être analysés afin de prévenir l'apparition de nouvelles intoxications en retirant de la vente et en détruisant les aliments avariés. Dans le cas spécifique du botulisme infantile, les selles sont les prélèvements privilégiés car elles rendent possibles la réalisation d'une coproculture permettant la détection des bactéries, en plus de la détection directe de la toxine.
4.6.1) Les tests in vivo
La méthode actuellement préconisée pour la détection des toxines botuliques est le test de létalité sur souris. (Gaithersburg, 2000; Gilligan, Brown, & Berman, 1983; Haim M. &
Lilly Jr, 2001) La DL50 chez la souris varie selon le sérotype de 0,4 à 2,5 pg par souris. (Gill,
1982) Ce test in vivo, dont le principe repose sur l'injection péritonéale d'une préparation
diluée d'un échantillon, présente l'avantage majeur d'être applicable à toute sorte de prélèvements et se décompose en trois étapes. Tout d'abord, des échantillons sont dilués et injectés aux souris, puis l'apparition des symptômes du botulisme et la survie des souris est suivie pendant 48 heures. (Ferreira, Eliasberg, Harrison, & Edmonds, 2001; Ferreira, 2001)
Dans un second temps, les échantillons positifs sont dilués en série. La DL50 murine des
toxines botuliques étant connue, les dilutions permettent d'estimer la concentration de toxine contenue dans l'échantillon, en déterminant la plus forte dilution qui engendre la mort de 50 % des souris. Finalement, afin de déterminer le sérotype responsable de l'infection il est nécessaire de tester au moins huit groupes de souris : un groupe pour chaque sérotype plus un groupe "témoin négatif". Chaque groupe de souris reçoit une injection de l'échantillon contaminé, à une concentration permettant de causer la mort des souris par botulisme, ainsi qu'un anticorps spécifique d'un seul sérotype. La survie de chaque groupe est observée pendant deux jours et seules les souris ayant reçu l'anticorps spécifique du sérotype à l'origine
de l'infection survivront. Ce test permet la détection d'une seule DL50 de BoNT par souris, soit
une concentration en toxine dans l'échantillon d'environ 10 à 20 pg.ml-1. Ce test est
néanmoins difficilement applicable dans les cas rares de contamination par deux sérotypes différents, et nécessite de trois à six jours pour obtenir les résultats définitifs.
En parallèle de ce test clinique, il existe un test non létal de paralysie flasque in vivo,
approuvé par l'Agence Européenne des Médicaments (European Medicines Agency, EMA)
pour doser la toxine botulique. (Bitz, 2010) Ce test basé sur l'injection sous cutané d'une quantité non létale de préparation contenant la toxine botulique, et sur l'évaluation de la paralysie flasque de la patte de souris induite par la toxine. Plus la solution est concentrée, plus la paralysie est importante, et une échelle de cinq niveaux permet d'estimer l'intensité de
la paralysie. (Adler et al., 2010; Straughan, 2006)
Un test ex vivo d'étude de la paralysie du muscle de l'hémidiaphragme permet aussi de
détecter la présence de toxine botulique. Ce test est basé sur la mesure de la diminution du potentiel de contraction musculaire en présence de la toxine botulique, en réponse à un stimulus électrique. (Rasetti-Escargueil, Liu, Rigsby, Jones, & Sesardic, 2011) Il permet de
détecter jusqu'à 2 DL50 de BoNT/A ou BoNT/E, 20 DL50 de BoNT/D et 60 DL50 de BoNT/B
ce qui est suffisant pour le dosage de préparations médicales de toxines botulique et pour l'étude d'anticorps neutralisant. Les résultats peuvent être obtenus 3 heures après dissection. Il nécessite le sacrifice de moins de souris que le test de létalié, puisque de deux à quatre souris suffisent par échantillons, ce qui le rend éthiquement plus acceptable.
4.6.2) Les tests in vitro
Les tests de diagnostic clinique in vitro pourraient être préférés aux tests in vivo grâce
à leur rapidité (résultats en quelques heures) et à leur simplicité. (Ekong, 2000) Si dans le passé, la plupart de ces tests avaient une limite de détection faible, les récentes innovations
apportées les rendent aussi performants que les méthodes de diagnostic in vivo. (Ferreira,
2001) Les tests ELISA spécifiques de la toxine botulique sont disponibles depuis le début des années 1980 (Dezfulian & Bartlett, 1985; Dezfulian, Hatheway, Yolken, & Bartlett, 1984;
Oguma et al., 1982), mais ils présentent généralement une limite de détection 10 à 100 fois
inférieure au modèle in vivo. Ils doivent donc être couplés à une technique puissante
d'amplification du signal, afin d'obtenir un seuil de détection comparable ou supérieur aux
test in vitro qui repose sur l'utilisation de colonnes comparables à des colonnes de purifications par immuno-affinité sur lesquelles un anticorps monoclonal spécifique de BoNT/B est greffé. Un peptide subtrat de BoNT/B est alors chargé sur la colonne, puis la quantité de peptides clivés est détectée par une méthode semblable à un ELISA. Ce test permet en 5 heures la détection de BoNT/B à une concentration pouvant aller jusqu'à
0,5 pg.ml-1 (0,5 DL50 murine de BoNT/B par millilitre), et il est donc plus sensible que le test
de létalité chez la souris. Notre laboratoire a mis au point un protocole de détection de BoNT/A à l'aide de colonnes qui sont aussi comparables à des colonnes de purifications par immuno-affinité. (Attrée, Guglielmo-Viret, Gros, & Thullier, 2007) L'anticorps monoclonal
murin de capture, mAb 11F7 (anti-BoNT/A1-HC), a été greffé sur la matrice de colonnes
Abicap® (Senova GmbH, Jena, Allemagne), puis l'échantillon est chargé sur la colonne. Un
anticorps polyclonal biotinylé de lapin (anti-BoNT/A) est alors ajouté, puis la colonne est
incubée en présence d'HRP (HorseRadish Peroxidase) conjugué à la streptavidine. La
révélation est réalisée par incubation avec du TMB. Le seuil de détection de BoNT/A sous
forme de complexes avec ces colonnes est égal à 67,5 ng.l-1 (5 DL50 murine de BoNT/A par
millilitre). Le protocole a été adapté pour pouvoir utiliser jusqu'à 5 ml d'échantillon, permettant de concentrer la toxine dans la colonne et donc d'abaisser le seuil de détection de
BoNT/A sous forme de complexes à 13,5 ng.l-1 (1 DL50 murine de BoNT/A par millilitre). Ce
test est donc aussi sensible que le test de létalité chez la souris et il est réalisable en moins d'une heure, et il équipe les hopitaux militaires français.
Des tests in vitro endopeptidasiques chimioluminescents ont aussi été développés pour
doser les lots de toxines botuliques et pour identifier des anticorps neutralisants. (R. G. A. Jones, Ochiai, Liu, Ekong, & Sesardic, 2008) Un peptide synthétique, SNAP25 ou VAMP2 selon le sérotype de toxine à tester, est adsorbé sur une plaque ELISA, puis la toxine spécifique du peptide est incubée. Après lavages, un anticorps monoclonal, spécifique d'un épitope accessible uniquement après clivage du substrat de la toxine, est incubé. Ce test
permet la détection de 40 fg.ml-1 (0,01 DL50) de BoNT/A ou 4,8 pg.ml-1 (0,2 DL50) de