Des relations temporelles Des relations temporelles

Na caracterização funcional foi observado que a Hsp110 de sorgo apresenta atividade chaperona, pois, protege substratos modelo contra a agregação induzida por aquecimento e por agente redutor, e mostrou ser específica, uma vez que a proteção ocorreu em diferentes graus dependendo do substrato modelo testado. Como controle negativo, observou-se que ao usar BSA ou aldolase, proteínas sem função chaperona, não ocorreu proteção. Na literatura já foram realizados experimentos com proteínas Hsp110s de mamíferos avaliando a prevenção da agregação induzida por aquecimento a 43 ºC por 30 minutos, no caso dos substratos modelo luciferase e citrato sintase, também medindo o espalhamento de luz a 320 nm (Oh et al., 1997). Nestes testes, com ambos os substratos, foi observada máxima eficiência de proteção utilizando a proporção de 1:1 (Hsp110:luciferase e Hsp110:citrato sintase), mostrando inclusive que a Hsp110 foi mais eficiente que a Hsc70, também testada na ocasião (Oh et al., 1997). Para a Hsp110 de sorgo, a máxima eficiência de proteção foi obtida na proporção 2:1 (Hsp110:citrato sintase) e

na proporção 10:1 (Hsp110:luciferase), o que mostra que há diferenças nas ações destas proteínas dependendo do organismo testado.

Nos testes de recuperação da atividade enzimática da luciferase desenovelada/agregada observou-se que nas condições testadas o sistema formado pelas proteínas Hsp110 de sorgo, Hsc70 e Hsp40 humanas foi capaz de recuperar parcialmente a atividade da proteína-cliente testada. Nos experimentos de reenovelamento houve recuperação de metade da atividade após 1 hora de incubação, enquanto que nos experimentos de desagregação houve recuperação de um terço da atividade após 3 horas de incubação. Na literatura já foram utilizados sistemas de reenovelamento/desagregação da luciferase usando diferentes combinações de chaperonas/co-chaperonas. Em Dragovic et al. (2006), foram realizados experimentos envolvendo Hsps de mamíferos e luciferase desenovelada com cloreto de guanidina e também com aquecimento, no caso aquecendo a luciferase a 42 °C por 12 minutos já na presença de Hsc70, de modo a se evitar a agregação. Em ambos os casos o reenovelamento foi realizado a 30 °C na presença de ATP, e a incubação por 1 hora contendo a mistura Hsc70/Hsp40/Hsp110 mostrou recuperação de cerca de 50 % da atividade enzimática da proteína-cliente luciferase. Já em Shorter (2011) foram realizados experimentos envolvendo luciferase previamente agregada com ureia e incubada de 0 - 6 horas a 25 °C na presença da proteína Apg-2, dos complexos Hsc70:Hdj1 / Hsp70:Hdj1, e de ATP, de modo a promover a desagregação proteica. Foi mostrado que a adição da proteína Apg-2 aumentou a atividade de desagregase e que ela não é capaz de promover a desagregação sozinha ou em combinação com a Hsc70, a Hsp70 ou a Hdj1 também sozinhas. Observou-se, no caso, maior eficiência de desagregação quando a incubação foi feita com a mistura Apg-2/Hsc70/Hdj1, na qual obteve-se cerca de 20 % de recuperação da luciferase. Também foi observado que a habilidade da Hsp110 em interagir com a Hsp70 e a Hsp40 para promover a desagregação proteica e reativação da luciferase é conservada em homólogos de levedura, como na Sse1 (Shorter, 2011). Em todos esses testes a recuperação enzimática foi medida através da luminescência gerada pela reação entre a luciferase e a luciferina.

Em Svetlov et al. (2006) foi realizado estudo com chaperonas moleculares do sistema Hsp70 (DnaK, DnaJ e GrpE) em extrato de E. coli no reenovelamento da luciferase. Neste caso a luciferase foi desenovelada com ureia a 20 °C por 5 minutos e nas condições testadas chegou a ser observada recuperação de cerca de 80 % da

atividade da luciferase dentro de 60 minutos de incubação a 25 °C. Em Sharma et al. (2010) foi também mostrado que o sistema em bactéria (Hsp70-Hsp40-NEF) pode eficientemente reenovelar espécies mal enoveladas da luciferase.

Por fim, este trabalho mostra que apesar de possuírem uma chaperona desagregase muito eficiente, a Hsp100, plantas podem se utilizar de um outro sistema na recuperação de proteínas, aquele formado por Hsc70/Hsp40/Hsp110. Animais perderam o gene da Hsp100 mas mantiveram o sistema Hsc70/Hsp40/Hsp110, que parece ser suficiente para lidar com os casos de agregação mais básicos, mas talvez não aqueles mais complexos causados por envelhecimento ou mutações. Plantas mantiveram os dois sistemas, provavelmente para lidarem de maneira mais eficiente com o maior número de condições estressantes a que estão continuamente expostas.

6. Conclusão

- O gene para hsp110 de sorgo foi clonado em vetor para expressão em bactéria. - A proteína foi expressa solúvel e purificada com alto teor de pureza (> 90 %) em duas etapas de cromatografia (afinidade em coluna de níquel e exclusão molecular). - Os experimentos de dicroísmo circular e fluorescência do triptofano mostraram que a proteína recombinante foi produzida enovelada, apresentando estrutura secundária do tipo hélice e evidenciando a presença de um ou mais resíduos de triptofano se encontrando, pelo menos parcialmente, enterrados no interior da proteína.

- Os experimentos de desenovelamento mostraram que a proteína é estável nas condições de estudo.

- A proteína produzida apresentou-se como um monômero em solução com formato alongado.

- A Hsp110 de sorgo apresentou atividade chaperona em diferentes proporções dependendo da especificidade do substrato modelo testado ao realizar experimentos de prevenção da agregação induzida tanto por aquecimento quanto por agente redutor.

- A Hsp110 tem papel essencial em um complexo chaperona que foi capaz de recuperar parcialmente a atividade enzimática da proteína-cliente luciferase testada tanto desenovelada quanto agregada, conservando a função desagregase inicialmente observada nas Hsp110s de mamíferos.

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8. Anexos