Toutes les mesures des formes phosphorylées/totales des protéines S6K1, Akt, et Erk1-2 présentées dans ce manuscrit ont été obtenues par l’utilisation d’une technique de déshybridation des anticorps. Ainsi, après la mesure des formes phosphorylées, les membranes ont étés incubées dans une solution permettant d’ôter tous les anticorps fixés dessus. Cela nous a permis de les réutiliser pour mesurer la forme totale des protéines sur la même membrane. Nous avons également utilisé cette technique de déshybridation des anticorps pour les mesures du niveau d’acétylation des histones (section VII, page 95).
Après révélation, les membranes ont étés déshybridées par incubation dans une solution composée de tris-HCL 62.5 mM à pH 6,8, SDS 1 % (v/v) et -Mercaptoéthanol 10 mM durant 40 min à 50°C sous agitation. Les membranes ont ensuite été lavées dans 3 bains d’H2O mQ durant 10 à 15 min puis de nouveau saturées durant 1 h. Enfin, elles ont été
incubées avec l’anticorps primaire de la forme totale de la protéine d’intérêt. Pour chacune de ces protéines, la qualité de la déshybridation a été validée une première fois par l’absence de signal après une incubation directement avec l’anticorps secondaire.
VII Les mesures du niveau d’acétylation global des histones
Les histones ont été extraites par précipitation à l’acide Trichloracétique (TCA) selon le protocole de Shechter et al [415]. De 10 à 20 mg de tissu ont étés broyés au potter en verre dans un tampon de lyse hypotonique (1ml/200mg de tissu) composé de Tris-HCL 10 mM à pH 8, KCl 1 mM, et MgCl2 1,5 mM et d’un ajout extemporané de DTT 1 mM, Fluorure de
phénylméthylsulfonyle (PMSF) 1 mM, Sodium butyrate 5 mM et un cocktail d’inhibiteur de protéase (cOmplete tablets, Roche, Bâle, Suisse). L’ajout du sodium butyrate permet d’éviter la déacétylation des histones au cours de l’extraction et du stockage des échantillons. Les homogénats obtenus ont été incubés 30 min sur un rotateur SB2 (Stuart, Stone, RU) à une température de 4°C. Ensuite nous avons centrifugé les échantillons à 10 000 g pendant 10 min à 4°C. Nous avons retiré entièrement les surnageants et suspendus à nouveau les culots dans 400 µl de H2SO4 à 0,4 N. Les échantillons ont ensuite incubés sur le rotateur durant la nuit à
réalisée afin de retirer les débris cellulaires. Nous avons transféré les surnageants contenant les histones dans un nouveau tube de 1,5 ml. Par la suite, 132 µl de TCA à 33 % (v/v) ont été ajoutés goutte à goutte et homogénéisés à la main jusqu'à obtenir une solution laiteuse. Une dernière incubation de 1 nuit à 4°C a été réalisée, suivie d’une centrifugation de 10 min à 16 000 g à la même température pour précipiter les histones. Nous avons précautionneusement pipeté les surnageants et nettoyé les culots à l'acétone glacial pour retirer l'acide sans perdre les histones présentes dans le culot. Puis les microtubes ont été centrifugés à 16 000g pendant 5 min à 4°C. Cette étape de rinçage a été réalisée 2 fois pour éliminer toute trace d’acide TCA. Enfin, les surnageants ont été récupérés avec attention pour ne pas perdre de culot puis séchés durant 20 min à température ambiante. Ensuite, nous les avons dissous dans de l'eau (H2O mQ à 100 µl pour 200 mg de tissu). Lorsqu’un culot insoluble
était présent, une centrifugation de 10 min à 16 000g à 4°C a été réalisée avant que les surnageants ne soient aliquotés et stockés à – 80°C.
Six microlitres d’histones purifiés ont été déposés sur des gels SDS-Page (voir section VI.B, page 91 pour détail) avec une concentration en acrylamide/bis-acrylamide de 20 % (Tableau 4, section VI.B, page 92). Un marqueur de poids moléculaire (DualColor de Biorad) et un pool d’échantillons ont étés déposés dans un puits de chaque gel afin de normaliser les mesures effectuées sur chacun des gels. Cela nous a permis de comparer les résultats obtenus sur différentes membranes. La référence des anticorps ainsi que les paramètres d’immunorévélation utilisés sont présentés dans le Tableau 5 (voir section VI.C, page 94).
VIII La mesure de la typologie musculaire
La typologie des muscles a été estimée par la mesure des différents isoformes de myosine selon la méthode de Talmadge et coll. [416]. De 5 à 10 mg (muscle soléaire) ou 10 à 20 mg (muscle plantaire) ont été homogénéisés au ciseau dans un tampon d’extraction (7 ml par mg de tissu). Ce tampon était composé de NaCl 0.3 M, NaH2PO4 0.1 M, Na2HPO4 0.05 M,
Na4P2O7 0.01 M, MgCl2-6H2O 1 mM, EDTA 10 mM, et 2-mercaptoethanol 1.4 mM. Le broyat
obtenu a été incubé durant 1 nuit à 4°C avant d’être centrifugé à 13 500 g pendant 10 min à 4°C. Le surnageant a ensuite été dilué au demi dans du glycérol, et dans du tampon de Laemmli dont la dilution a été ajustée en fonction du muscle et de l’intervention chirurgicale (plantaire-
Sham 1/400, Plantaire-chirurgie 1/100 ; Soléaire-Sham 1/300, Soléaire-chirurgie 1/150).
Huit microlitres de chaque échantillon de tissu musculaire ont été séparés par électrophorèse dans des gels de 0,75 mm d’épaisseur composés d’une phase de concentration : glycérol 30 % (v/v), acrylamide/bis-acrylamide (50 :1) 4 %, Tris-HCl 0,2 M à pH 6,8, EDTA 4 mM, SDS 0,4 % (v/v), APS 0,1 % (v/v), TEMED 0,1 % (v/v), H2O ultrapure qsp
3,75 ml, et d’une phase de séparation : glycérol 30 % (v/v), acrylamide/bis-acrylamide (50 :1) 8 %, Tris-HCl 0,2 M à pH 8,8, glycine 0,1 mM, SDS 0,4 % (v/v), APS 0,1 % (v/v), TEMED 0,05 % (v/v), H2O ultrapure qsp 7,5 ml. La migration a été réalisée à voltage constant de 90 v durant
30 h avec le système mini-PROTEAN II (Biorad, Hercules, Californie, USA) en chambre froide à une température de 4°C.
Les MHC ont été colorées à l’aide d’un kit de coloration des gels à l’argent (SilverQuestSilverstaining Kit, Novex, Levallois-Perret, France). Les gels ont été lavés brièvement dans de l’eau miliQ à la fin de l’électrophorèse puis placés dans une solution de fixation (éthanol 40 % (v/v), acide acétique 10 % (v/v), H2O miliQ) durant au moins 20 min pour
éviter une diffusion passive des protéines. Ensuite, les gels ont été lavés dans une solution d’éthanol 30 % (v/v) durant 10 min avant de les incuber durant 10 autres minutes dans la solution de sensibilisation du kit. A l’issue de cette incubation, les gels ont été lavés dans la solution d’éthanol 30 % durant 10 min puis lavés dans 100 ml d’eau miliQ durant 10 min. Une incubation a ensuite été effectuée durant 15 min dans la solution de coloration fournie par le kit, puis les gels ont étés lavés brièvement (20 à 60 s) dans 100 ml d’eau miliQ. Il est important que cette étape ne dépasse pas la minute sous peine de diminuer la sensibilité de détection du kit. Pour finir, les gels ont été incubés dans la solution de développement pendant 4 à 8 min selon l'intensité désirée. Le développement a ensuite été arrêté par addition de 10 ml de solution dite "Stop".
IX Mesure de l’activité de la citrate synthase
La Citrate Synthase (CS) est une enzyme spécifique du cycle de Krebs qui forme du citrate à partir de l’oxaloacétate et de l’acétyl-CoA. Durant ce travail, son activité a été mesurée par la technique colorimétrique de Faloona et Srere [417]. Celle-ci est basée sur l’interaction entre l’acide dinitrothiobenzoïque (DTNB) et les Coenzymes A libérés par l’acétyl-
CoA en présence d’oxaloacetate (Équation 1). L’apparition de l’ion mercaptide (C6O4S2-)
produite par cette réaction chimique, colore le milieu réactionnel avec une longueur d’onde d’absorption de 412 nm. C’est la cinétique d’absorption du milieu réactionnel, mesurée par spectrophotométrie (Specord 210, Analytik Jena, Sint Aubin, France) qui permet de déterminer l’activité de la CS.
La mesure de l'activité de la CS est exprimée par quantité de tissu, et est classiquement employée pour évaluer la densité mitochondriale dans les tissus [418].
Acetyl-CoA + Oxaloacétate + H2O Citrate + CoA + H+
CoA-SH + DTNB CoA-S + C6O4S2- + H+
Équation 1 : Réactions chimiques de dégradation de l’acétyl-CoA + oxaloacétate en citrate et CoA + H+ par la Citrate Synthase (CS), et apparition du C6O4S2- à partir du CoA-SH formé précédemment. C6O4S2- est l’élément chimique mesuré par spectrophotométrie pour déterminer l’activité de la CS.
X L’expression des ARN messagers
Afin d’éviter toute dégradation des ARN, tous les ustensiles ont été trempés durant 1 nuit dans une solution de SDS de concentration massique de 5 g.L-1 diluée dans de l’eau
DEPC, puis autoclavés. L'eau DEPC est obtenue à partir d'1 ml de DEPC (Sigma D-5758) dilué dans 1 l d’eau milliQ, ce mélange étant ensuite laissé au repos durant quelques heures à l’abri de la lumière puis autoclavé.
De 20 à 30 mg de tissus ont été homogénéisés à l’aide d’un broyeur à billes (MM301 ; RetschTechnology, Haan, Allemagne) durant 2 fois 75 s à 30 Hz dans un eppendorf de 2 ml contenant 2 billes d’acier inoxydable de 3 mm de diamètre et 1 ml de tampon QIAzol à 4°C (QIAGEN, Hilden, Allemagne). Les homogénats ont été centrifugés à 12 000 g durant 10 min à une température de 4°C, puis les surnageants (environ 920 µl) ont été transférés dans des tubes propres de 1,5 ml. Après un période de 5 min à Température Ambiante (TA) 0,2 ml de
chloroforme (Sigma-2432) ont été ajoutés. Le mélange a ensuite été agité vigoureusement à la main durant 15 secondes jusqu'à obtenir une solution laiteuse uniforme. Après 2 à 3 minutes d’incubation à TA, les échantillons ont été centrifugés durant 15 min à 15 000 g à 4°C. Trois phases distinctes sont ainsi obtenues, et décrites sur la Figure 40A. Environ 500 µl de la phase contenant les ARN totaux (phase supérieure de couleur jaune translucide) a été récupérée et transférée dans un microtube propre. Un volume de 500 µl d’isopropanol a été ajouté au mélange pour faire précipiter les ARN. Après avoir été agité vigoureusement, les tubes ont été laissés reposer 10 min à TA, puis centrifugés à 12 000 g durant 10 min à 4°C.
Figure 40 : Représentation schématique de deux étapes de l'extraction de l'ARN au QIAzol. (A) Les phases contenant ARN totaux, ADN et protéines sont indiquées par les couleurs jaune translucide, gris et violet, respectivement (de haut en bas). (B) Apparence du culot d’ARN une fois précipité à l’isopropanol. Les ARN totaux sont indiqués en gris.
Le surnageant a été éliminé, laissant apparaitre un culot d’ARN légèrement translucide visible dans le fond de du microtube (Figure 40B). Ces culots ont été lavés 2 fois avec 1 ml d’éthanol 70 % puis centrifugés à 7 500 g durant 5 min à 4°C entre chaque lavage. Durant ces étapes, nous avons bien veillé à ne pas pipeter le culot d’ARN. A l’issue de la dernière centrifugation, les culots ont été laissés sécher durant 5 min à l’air libre. Durant cette étape, un blanchissement des culots a été observé. Les culots ont ensuite étés re-suspendus dans
ARN totaux
Protéines
ADN
ARN totaux
50 µl d’eau RNase free (Ref : 10977-035, GIBCO, Carlsbad, Californie, USA) et incubés à 60°C durant 10 min pour faciliter leur dissolution. Les échantillons ainsi obtenus ont été aliquotés en 3 microtubes de 15 µl, et les 5 µl restant ont été gardés pour effectuer le dosage de la quantité d’ARN obtenu et estimer leur pureté.
La mesure de la quantité d’ARN et de la pureté des échantillons a été réalisée par spectrophotométrie (Nanophotometer, IMPLEN, Munich, Allemagne). Chaque mesure de spectrophotométrie a été effectuée à partir de 1 µl d’échantillon déposé sur la lentille de lecture de l’appareil. Au moins deux mesures sur chaque échantillon ont été systématiquement réalisées. Lorsque la différence entre ces deux mesures était supérieure à 20 µg.ml-1, des mesures supplémentaires ont été réalisées pour valider l’une de ces deux
valeurs. La concentration en ARN et la pureté de chaque échantillon a été mesurée en utilisant 3 longueurs d’ondes différentes (230, 260 et 280 nm). La pureté est définie comme le rapport entre les acides nucléiques et les protéines, ainsi que le rapport entre les acides nucléiques et les molécules organiques présentes dans l’échantillon. La concentration en ARN totaux est calculée selon la relation : Densité Optique à 260 nm = 1 pour une concentration en ARN égale à 40 μg.mL-1. Pour compléter cette mesure, nous avons vérifié l’intégrité de nos ARNm de
manière aléatoire par électrophorèse des acides nucléiques. Ces dernières avaient été préalablement incubées avec un intercalant fluorescent aux ultraviolets (le bromure d’ethidium) et séparées sur un gel d’agarose 1 %.
Afin de limiter tout risque de contamination de nos échantillons par de l’ADN génomique, une étape de digestion de l’ADN a été ajoutée préalablement à la transcription des ADN complémentaires (ADNc). Pour cela, 1 µg de chacun des échantillons d’acides nucléiques a été dilué dans de l’eau RNase free pour obtenir un volume final de 8 µl. Un volume d'1 µl de tampon DNase 10X (kit DNase, Invitrogen, Carlsbad, Californie, USA) et 1 µl d’une enzyme DNase ont ensuite été ajoutés avant une incubation de 15 min à TA. Ensuite, 3 µL d’une solution composée d’EDTA 25 mM à pH = 8, oligo(dt)20 à 0,5 μg/μL, et dNTP mix ont été ajoutés et mélangés doucement à la pipette. Cette étape permet d'inactiver l’enzyme de dégradation de l’ADN et permet l’hybridation des oligo(dt)20 avec les ARNm polyadénylés. Après une incubation de 10 min à 65°C, les tubes ont étés placés dans la glace durant 1 à 2 minutes puis centrifugés quelques secondes. 7 µl d’une solution composé par du Tampon RT 5X, du DTT 10 mM, la RNase OUT 2 U.µl et l’enzyme RT 10 U.µl (SuperScript® III, Invitrogen,
Carlsbad, Californie, USA) ont ensuite été ajoutées dans chaque échantillon. Les volumes finaux de 20 µl ont été incubés pendant 45 min à 50°C. Durant cette incubation, les ARN sont transformés en ADNc par les enzymes, puis les échantillons ont été chauffés à 70°C durant 10 min pour désactiver définitivement l’enzyme de RT. Pour finir un pool a été créé à partir de 1 µl de chaque échantillon qui a ensuite été congelé à -20°C.
Les mesures d’ARN messagers que nous présentons dans ce manuscrit ont été effectuées par réactions de polymérisations en chaine en temps réel (PCr) sur un appareil thermocycleur Ligthcycler 1.5 (Roche, Bâle, Suisse) avec des amorces définies par le programme ProbeFinder (Roche, Bâle, Suisse) et le kit Fast Start DNA Master (Roche, Bâle, Suisse). Lors de nos expérimentations, nous avons utilisés 15 µl de milieu réactionnel contenant l’enzyme et les amorces ( Tableau 4) et 5 µl d’échantillon que nous avons déposés dans chaque capillaire prévu à cet effet. Les capillaires ont ensuite été centrifugés pendant 5 secondes à une accélération de 700 g (LC Carousel Centrifuge, Roche, Bâle, suisse), puis placés dans le thermocycleur Lightcycler.
Tableau 6 : Séquence des amorces utilisées pour la RT-PCr.
Amorces Séquences sens Séquences antisens Lg Amplicon
Hprt1 5'-ggtccattcctatgactgtagatttt-3' 5'-caatcaagacgttctttccagtt-3' 126 VEGF 5'-gagagcaacgccactatgc-3' 5'-cgccttggcttgtcacat-3' 146 MAFbx 5'-gcttgtgcgatgttacccaagaa-3' 5'-tgaaagtgagacggagcagctct-3' 139 MuRF-1 5'-agcattgtagaagcttccaagg-3' 5'-gtaaactcctcctcctcatctgtc-3' 146 NF-kB 5'-atgctgagcagtggctga-3' 5'-tgccctgctattaaggcact-3' 120
HDAC5 5'-cctggtttctgctggatttg-3' 5'-tcgtcaaatgaccaaagcat-3' 92
HDAC9 5'-tgcccttctaggaaatgagc-3' 5'-agcggctgcattcgtatt-3' 76
HDAC9-MITR 5'-taccgaaaacgaggcttca-3' 5'-tcagaatgcgctgctgtg-3' 74 MHC-I 5'-ttgctctacccaaccctaaggatg-3' 5'-ttgtgtttctgcctgaaggtgc-3' 81 MHC-IIa 5'-ctcaggcttcaagatttggtgg-3' 5'-ttgtgcctctcttcggtcattc-3' 265 MHC-IIx 5'-ggaggaacaatccaacgtcaacc-3' 5'-ggtcactttcctgctttggatcg-3' 178 MHC-IIb 5'-cacgaagcgtgtcatcca -3' 5'-aggtttcgatatctgcggagg-3' 242
Hprt1 : Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 ;VEGF : Vascular endothelial growth factor; MAFbx: Atrogine 1; MuRF-1: Muscle Ring Factor-1; NF-kB: Nuclear Factor kappa B; HDAC: Histone Deacetylase; MHC: Myosin Heavy Chain.
Toutefois, l’efficacité de la PCr varie d’un couple d’amorces à un autre et nécessite donc l’adaptation des durées des cycles, de leurs températures, et de la composition du milieu
réactionnel. Pour cela, le coefficient d’efficacité de chaque couple d’amorces a été calculé à partir d’une gamme étalon réalisée par dilution avec le pool d’échantillons créé au moment de la transcription des ADNc. Ces mises au point permettent de vérifier le taux d’efficacité de réplication du codon ciblé par les amorces, et de contrôler la sélectivité des produits de l’amplification. Nous avons retenu les paramètres de PCr et les couples d’amorces (Tableau 7) lorsque l'efficacité était comprise entre 90 et 110 % de doublement des séquences d’ARN cible à chaque cycle et que la courbe de dissociation des acides nucléiques (appelée courbe de fusion) ne présentait qu’un seul pic bien distinct, synonyme d’une amplification spécifique de l’ARNm ciblé.
Tableau 7 : Conditions de RT-PCR pour les différentes amorces. L’amorce en bleu correspond au gène utilisé comme référence dans ce manuscrit.
Amorces [MgCl2] (mM) [Amorces] (µM) Hybridation Elongation (sec) Temp (°C) Durée (sec) Hprt1 4 0,66 53 5 7 VEGF 4 0,66 54 5 7 MAFbx 4 0,66 52 5 6 MuRF-1 3 0,66 56 6 6 NF-kB 3 0,66 59 5 5 HDAC5 4 0,66 55 5 6 HDAC9 4 0,66 53 6 6 HDAC9-MITR 4 0,33 55 6 6 MHC-I 4 0,66 49 6 15 MHC-IIa 4 0,66 49 6 15 MHC-IIx 4 0,66 51 5 8 MHC-IIb 4 0,66 59 6 8
Hprt1 : Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 ;VEGF : Vascular endothelial growth factor; MAFbx: Atrogine 1; MuRF-1: Muscle Ring Factor-1; NF-kB: Nuclear Factor kappa B; HDAC: Histone Deacetylase; MHC: Myosin Heavy Chain.
Les valeurs des différents CT ont été déterminées selon la méthode des "fit points", à
par la méthode de Livak et coll. [419], connue sous le nom de méthode des ΔΔCT. Celle-ci
permet d’obtenir des valeurs d'expressions relatives au groupe contrôle après correction par le coefficient d'efficacité des amorces et du gène de référence. C’est l’Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (Hprt1) qui a été utilisé comme gène de référence durant ce travail (amorce en bleu dans le Tableau 6). La stabilité de ce gène de référence a été validée avec le logiciel geNorm [420], et le CT moyen utilisé dans la formule de calcul correspond à
leur moyenne géométrique. La formule employée pour calculer le niveau d’expression de l’ARNm cible est la suivante :
𝑨𝑹𝑵𝒎= (𝟏 + 𝑬)(∆𝐂𝐓.𝐫𝐞𝐟 – ∆𝐂𝐓.𝐜𝐢𝐛𝐥𝐞)
∆CT. ref = C̅̅̅. 𝑐𝑖𝑏𝑙𝑒𝑇 (𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟ô𝑙𝑒𝑠)− C̅̅̅. 𝑟𝑒𝑓𝑇 (𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟ô𝑙𝑒𝑠)
∆CT. cible = C𝑇. 𝑐𝑖𝑏𝑙𝑒(é𝑐ℎ𝑎𝑛𝑡𝑖𝑙𝑙𝑜𝑛)− C𝑇. 𝑟𝑒𝑓(é𝑐ℎ𝑎𝑛𝑡𝑖𝑙𝑙𝑜𝑛)
Équation 2 : Equations employées pour calculer la quantité d’ARNm présente dans les échantillons. E : Efficacité des amorces, cible : ARNm d’intérêt, ref : gène(s) de référence(s), Contrôles : groupe contrôle.CT : Cycle Thresold ; 𝐶̅̅̅ : correspond à la moyenne arithmétique 𝑇
des CT des ARN cibles ou de références du groupe contrôle.
XI Les analyses statistiques
La majorité des analyses statistiques ont été conduites à l'aide du logiciel SigmaPlot 11.0 (Systat Software Inc., Washington St, Chicago, USA). Nous avons opté pour la méthode d’analyse de variance (ANOVA) omnibus bilatérale à 2 voies (LPS & Hypoxie) lorsque la population étudiée répondait à la loi normale (test du χ2) et avait une variance homogène entre les groupes (test de Fisher). Lorsque un seuil de significativité inférieur à 5 % était détecté (p<0.05), un test post hoc de Holm-Sidak a été réalisé afin de connaitre la nature de l’effet observé. Pour les populations répartis selon une distribution non-normale et/ou une variance inhomogène, deux approches ont été retenues. Dans le premier cas, nous avons
favorisé un test non paramétrique en simplifiant les tests des différentes conditions avec un test post-hoc de Tukey. Dans le second cas, nous avons utilisé un script s’appuyant sur les modèles mixtes sous l’interface « Rcommander » du logiciel de statistique R (R Foundation for Statistical Computing, Vienne, Autriche). Les coefficients de corrélation présentés dans ce manuscrit ont été déterminés avec un test de Pearson.
RESULTATS
I Etude 1 : Développement d’un système d’acquisition vidéo de l’activité physique spontanée.
Cette étude présente une technique d’acquisition de l’APS afin d'estimer les perturbations de la locomotion induites par les 2 stimuli de notre modèle: l’inflammation pulmonaire et/ou l’hypoxie chronique. Les variations de l’APS d'animaux soumis à une hypertrophie de surcharge des muscles soléaire et plantaire ont été quantifiées.
Ce travail a été publié dans le Journal of Applied Physiology [413].