Détection des espèces réactives de l’oxygène

L’efficacité du traitement couplant radiothérapie et PDT repose sur la capacité de la

nanoparti-cule à augmenter la génération d’espèces réactives de l’oxygène, afin d’augmenter les dégâts létaux

à la cellule par stress oxydant.

Afin d’évaluer la capacité des nanoparticules à induire la production d’ERO nous avons utilisé une

sonde qui en présence d’ERO devient fluorescente. Cette sonde laH

₂

-DCFDA

(2’7’Dichlorofluorescéine-diacétate)(Molecular Probes, Eugene, E.U.) détecte principalement le peroxyde d’hydrogène (H

₂

O

₂

)

et le radical hydroxyle (OH

^.

). Sous sa forme estérifiée, laH

₂

-DCFDA traverse les membranes

plas-miques, puis est hydrolysée par les estérases intracellulaires en Dichlorofluorescéine (DCFH). En

présence d’ERO notammentH

₂

O

₂

et OH

^.

la DCFH est oxydée en Dichlorofluorescéine (DCF) qui a

des propriétés fluorescentes (λ

em

: 530 nm).

– Jour 1 Les cellules U87 sont ensemencées en plaque 24 puits à 5, 5.10

⁴

cellules/ml (500

µl/puits) dans du milieu de culture complet. 3 puits par condition sont prévus.

– Jour 4 Les différentes conditions de nanoparticules sont mises à incuber pendant 24 heures

avec les cellules U87 à une concentration de 600µM de Tb pour les nanoparticules de Tb et

Tb@P1, et 120µM de P1 (équivalent de Tb) pour la P1.

– Jour 5 Le milieu contenant les nanoparticules est éliminé puis les puits lavés 2 fois à l’HBSS.

La sondeH

₂

-DCFDA à 10µM diluée dans du milieu OPTI-MEM (Gibco, Invitrogen) est ajoutée

à tous les puits sauf les puits témoins négatifs qui reçoivent 500µl de milieu OPTI-MEM. Les

plaques sont incubées 30 min à 37°C.

– Le milieu est à nouveau éliminé, puis les puits lavés 2 fois à l’HBSS. La solution de TBHP

(Tert-Butyl Hydroperoxide 70% dans l’eau) est ajoutée à 500µM diluée dans l’OPTI-MEM aux puits

témoin positif (500µl/puits). Tous les autres puits reçoivent 500µl/puits d’OPTI-MEM. Les

plaques sont incubées pendant 1 heure à 37°C.

– Les plaques sont ensuite irradiées à 160 keV à 0, 2, et 4 Gy.

– Immédiatement après irradiation, le milieu est éliminé, les puits lavés 2 fois à l’HBSS et 500

µl/puits de DMSO sont ajoutés pour lyser les cellules. 145µl de chaque puits sont prélevés et

déposés dans un tube eppendorf de 1,5 ml puis 55µl de solution NaCl à 36% (3,6 g dans 10 ml

d’eau distillée) y sont ajoutés pour faire précipiter les nanoparticules. Les tubes sont vortexés

2.6. Détection des espèces réactives de l’oxygène

– 150µl par tubes sont transvasés dans une plaque 96 puits noire pour la lecture de la

fluores-cence au TECAN avec les réglages suivants :λ

_{E x c}

:480 nm,λ

_Em

:530 nm, gain : 180, temps

d’intégration : 30µs).

3

Résultats

Sommaire

3.1 Propriétés photophysiques du nano-objet . . . 173

3.2 Cytotoxicité des nanoparticules . . . 177

3.3 Incorporation cellulaire des nanoparticules . . . 178

3.4 Formation d’espèces réactives de l’oxygène . . . 181

3.5 Interaction rayonnements-nanoparticule-photosensibilisateur . . . 182

3.5.1 Irradiation à une forte énergie (6 MV) . . . 183

3.5.2 Irradiation à une faible énergie (160 keV) . . . 184

3.1 Propriétés photophysiques du nano-objet

Le protocole de synthèse des AGuIX à base de gadolinium a été largement décrit. Les

nanoparti-cules utilisées dans cette étude, des AGuIX à base de terbium, ont été élaborées selon le même type

de procédé de synthèse[201], mise à part que l’ajout du photosensibilisateur a eu lieu pendant la

synthèse de la nanoparticule, et non après.

FIGURE 41 – Schéma simplifié de la nanoparticule de terbium fonctionnalisée par une porphyrine

(Tb@P1). La matrice de polysiloxane (grise) supportent des atomes de terbium (jaune) chelatés

par du DOTA (brun), ainsi qu’une molécule de porphyrine. La nanoparticule de terbium (Tb) est

composée uniquement d’une matrice de polysiloxane et d’atomes de terbium chelatés par du DOTA.

Ce sont des édifices composés d’un réseau en polysiloxane portant en périphérie des atomes de

terbium chelatés avec du DOTA (1,4,7,10-tetra-azacyclododecane-1-glutaric anhydride-4,7,10-triacetic

acid) greffé covalemment à la matrice inorganique. Le greffage du photosensibilisateur qui est une

TPP, (5-(4-Carboxyphényl)-10,15,20-(triphényl)porphyrine), est obtenu par la formation d’une

liai-son peptidique entre la fonction amine libre sur la nanoparticule et le groupement carboxylique de

la TPP (Figure 41).

Pour contrôler que les effets induits par la nanoparticule de terbium couplée à la porphyrine,

appelée Tb@P1 proviennent bien de l’édifice en lui-même et pas simplement de la mise en présence

du Tb et de la porphyrine, nous avons étudié cinq conditions, rappelées ci-dessous :

1. La première condition est la conditionRX seul, où les cellules ne reçoivent qu’un seul

traite-ment : les rayonnetraite-ments X.

2. La seconde condition est la conditionTb, où les cellules sont mises en contact avec des

nano-particules de Tb à la concentration de 600µM de Tb et reçoivent ensuite les rayonnements.

3. La troisième condition est la condition P1, où les cellules reçoivent 120 µM de P1 seule et

ensuite les rayonnements.

4. La quatrième condition est la conditionTb@P1où les cellules sont mises en contact avec des

nanoparticules de Tb greffées avec la P1 à une concentration de 600µM de Tb (soit 120µM

de P1), et reçoivent ensuite les rayonnements.

5. La cinquième condition est la conditionTb + P1 où les cellules sont mises en contact avec

un mélange de nanoparticules de Tb à 600µM, et de P1 à 120µM, et reçoivent ensuite les

rayonnements.

Taille. Le diamètre hydrodynamique a été mesuré par la méthode DLS (Dynamic Light Scattering),

et les graphiques de dispersion de taille de la population montrent que les nanoparticules de Tb (en

noir) sont monodisperses, et affichent un diamètre moyen de 3,1 nm (Figure 42.A). Ce diamètre

hydrodynamique correspond à celui des AGuIX de gadolinium (cf. résultats partie 2)[210]. La

dis-tribution de taille des nanoparticules Tb@P1 (en bleu) présentent un double pic à 3,0 et 7,5 nm, qui

pourraient représenter deux sous-populations qui ne sont pas nettement séparées. La sous population

à 3,0 nm pourrait être constituée de nanoparticules de Tb non greffées à la P1, et la sous-population

à 7,5 nm correspondre aux nanoparticules de Tb conjuguées à la P1 (Figure 42.A).

Spectre d’absorption. Le spectre d’absorption est caractéristique des porphyrines (en rouge) et

présente un pic majeur à 420 nm appelé bande de Soret, et quatre pics mineurs à 520 nm, 555 nm,

590 nm et 650 nm, appelés bandes Q (de QIV à QI respectivement). Nous constatons que le spectre

d’absorption de la nanoparticule Tb@P1 est identique à celui de la P1, confirmant que le greffage de

la P1 sur la nanoparticule n’altère pas ses propriétés d’absorption (Figure 42.B).

Taux de greffage en porphyrine. Après reconstitution dans l’eau milliQ d’un aliquot de

nanopar-ticules dont la quantité de terbium est connue, le taux de greffage a été mesuré d’après une gamme

étalon en absorption de la P1 diluée dans du DMSO:H

₂

O (1:125) pour se rapprocher au plus du

mi-lieu de dilution des nanoparticules. Le nombre de P1 par atome de Tb a été évalué à 0,2 P1/Tb soit

1 P1 pour 5 atomes de Tb, correspondant à 1 à 2 P1 par nanoparticule. Cependant, les graphiques

de dispersion de diamètre hydrodynamique semble indiquer qu’une sous population de

nanoparti-cules non greffées existe. Il est possible qu’une quantité minime de P1 dans l’échantillon ne soit pas

Dans le document Thérapies par rayonnements appliquées au cas du glioblastome : Intérêt du suivi par spectroscopie et imagerie de diffusion par résonance magnétique. Vers une thérapie bimodale. (Page 185-190)