Capacité clonogénique

cellulaire a été centrifugée (300 g, 10 min) afin de ne récupérer que le culot cellulaire. Celui-ci

a été conservé à−20C et envoyé à Lyon pour le dosage ICP-OES.

Les étapes du dosage ICP-OES sont rapidement exposées :

– Une minéralisation de l’échantillon par dissolution dans un acide, 3 heures à 80°C, est réalisée.

– L’échantillon est ensuite filtré (0,2µm) puis injecté et nébulisé.

– L’échantillon est ensuite ionisé. Ces étapes font appel à la partie plasma de gaz rare induit par

couplage haute fréquence.

– L’échantillon est ensuite analysé en spectroscopie par émission optique. Les atomes ionisés

émettent un photon à une longueur d’onde spécifique lorsqu’ils retournent à leur état

fonda-mental. C’est cette propriété qui est utilisée pour caractériser la constitution d’un échantillon.

Une gamme étalon avec des concentrations connues de l’élément à doser est réalisée en

paral-lèle.

L’expérience a été réalisée sur trois passages cellulaire différents. Les résultats sont exprimés en

ppb (partie par billion) correspondant à desµg/l. Le nombre de cellules étant connu, la

quantifica-tion finale est exprimée enµg de Tb/1.10

⁶

cellules.

L’incorporation de la P1 et des nanoparticules Tb@P1 a été suivie par fluorescence avec le système

de lecture de fluorescence microplaque TECAN Infinite M200.

– Jour 1Les cellules U87 sont ensemencées dans des flacons de culture cellulaire T25 à 4.10

⁴

cellules/ml pour que 48 heures après le tapis cellulaire soit à 60-70% de confluence.

– Jour 3Après 48 heures d’incubation à 37°C, le milieu des boites est éliminé et remplacé par

un milieu contenant les nanoparticules Tb@P1 ou la P1 seule. La solution mère de Tb@P1

est d’abord préparée dans l’eau milliQ à une concentration de 100 mM puis diluée dans du

milieu de culture à 600 µM. La solution mère de P1 est d’abord préparée dans du DMSO à

une concentration de 100 mM puis diluée dans du milieu de culture à 1 mM pour obtenir une

solution de travail à 120µM de P1 (équivalent Tb) ne contenant pas plus de 0,12% de DMSO.

– Jour 4Après 24 heures de contact entre les cellules et les nanoparticules le milieu de culture

est éliminé, le tapis cellulaire lavé 2 fois à l’HBSS puis les cellules trypsinées. Les cellules sont

comptées avec le compteur automatique TC 20 : 2 comptages par condition sont réalisés. La

suspension cellulaire est ensuite centrifugée à 300 g pendant 10 min. Le culot est resuspendu

dans 2 ml de tampon de lyse ( 0,5% Triton 100X, 0,2N NaOH, qsp PBS) pendant≈5 min. Après

homogénéisation, 200µl du lysat sont déposés par puits dans une plaque noire 96 puits. 6 puits

par condition sont réalisés. La lecture de fluorescence est réalisée avec les réglages suivants,

λ

e x c

: 420 nm etλ

em

: 650 nm.

L’expérience a été réalisée sur trois passages cellulaire différents. Les résultats sont exprimés en

nmoles de P1 incorporées/1.10

⁶

cellules.

2.5 Capacité clonogénique

Le test de capacité clonogénique a pour but de caractériser l’effet des rayonnements sur la

ca-pacité de division des cellules en tenant compte des effets tardifs et/ou précoce selon le moment

choisi pour réaliser le test. Un des points majeurs dans la réussite d’un traitement et la capacité à

engendrer des dégâts létaux, immédiats ou différés. Les dégâts induits par les radiations ionisantes

peuvent-être pris en charge par le système de réparation de la cellule ou par des voies de survie de la

cellule. A terme, la cellule peut donc arrêter de se diviser et mourir ou réparer avec succès et survivre.

Le test clonogénique permet de visualiser les cellules ayant toujours des capacités clonogéniquesi.e.

de division. Le nombre de clones définit la résistance de la lignée cellulaire aux rayonnements.

FIGURE 39 – L’expérimentation se déroule sur 2 semaines, de l’ensemencement à la révélation des

colonies après irradiation. L’irradiation à lieu 24 heures après la mise en contact des cellules avec les

nanoparticules. Celles-ci sont retirées du milieu juste avant irradiation. Les essais clonogéniques en

soft agar sont ensemencées 16 heures ou 1 heure post-irradiation afin de cumuler les effets directs

et différés ou non. Les cellules sont incubées 12 jours avant le comptage des clones.

Pour cette expérimentation (Figure 39) :

– Jour 1Les cellules U87 sont ensemencées dans des flacons de culture T25 à 4.10

⁴

cellules/ml.

– Jour 3Les cellules sont ensuite mises en contact avec les différentes conditions : Tb, Tb@P1,

P1 et Tb+P1 à 600µM équivalent Tb diluées dans du milieu de culture après préparation des

solutions mères (vues précédemment).

– Jour 424 heures après la mise en contact les flacons de culture sont vidés, lavés 2 fois avec de

l’HBSS, puis le milieu est remplacé par du milieu sans nanoparticules. Les flacons sont ensuite

irradiés.

– Plusieurs irradiations ont été réalisées :

1. La première a été conduite sur un appareil clinique constitué d’un faisceau de photons de

6 MV produit par un accélérateur linéaire Clinac iX (Varian Medical Systems) situé dans

le service de radiothérapie du CHR Metz-Thionville, Hôpital de Mercy (Figure 40). Les

cellules ont été irradiées à 0, 2, 4, 6 et 10 Gy. Les cellules sont ensuite mises à l’incubateur

(37°C, 5% CO

₂

, 95% d’humidité) et trypsinées pour ensemencer les essais clonogéniques

16 heures après l’irradiation.

2. La seconde a été conduite sur un appareil préclinique (Model Xrad 320, Precision XRay

Inc, Cegelec) équipé d’un tube à rayons X d’un potentiel maximum de 320 keV et une

puis-sance de 4000 W. Les irradiations ont été réalisées avec une énergie de 160 keV à 0, 2, 4,

6 et 10 Gy. Les cellules sont ensuite mises à l’incubateur (37°C, 5% CO

₂

, 95% d’humidité)

et trypsinées pour ensemencer les essais clonogéniques 16 heures après l’irradiation.

3. La troisième a été conduite dans les mêmes conditions que la seconde irradiation excepté

que les cellules ont été trypsinées et ensemencées 1 heure après l’irradiation.

– Jour 5 (Jour 4 pour la troisième irradiation) Les essais clonogéniques sont ensuite réalisés

2.5. Capacité clonogénique

plaques 6 puits puis laissé sous la hotte en attendant sa solidification. Les cellules sont ensuite

trypsinées et comptées au compteur automatique TC20. Deux comptages par condition sont

réalisés. Trois puits par condition sont ensemencés avec 10 000 cellules/puits. Après avoir

prélevé la quantité de cellules nécessaire, la suspension est centrifugée (300 g, 10 min) et le

culot repris dans de l’agar 0,3% à une concentration de 10 000 cellules/ml. La seconde couche

d’agar contenant les cellules est déposée sur la première à raison d’1 ml/puits. 3 puits pour

chaque condition sont prévus, chaque puits est recouvert d’ 1 ml de milieu de culture complet.

La lecture des essais clonogéniques est réalisée après 12 jours d’incubation à 37°C.

– Jour 17Pour la révélation des colonies, le milieu de culture est éliminé, et 1 ml de solution

de MTT à 1 mg/ml est ajouté et incubé 3 heures à 37°C à l’obscurité pour colorer

unique-ment les colonies vivantes. Le comptage des colonies est réalisé par un compteur de colonies

automatique Gel count™ (Oxford Optronix, Abingdon, R.U.).

Les expérimentations ont été menées sur 4 passages cellulaires différents.

FIGURE 40 – Illustration du protocole d’irradiation à 6 MV. Les boîtes de culture de cellules sont

contenues entre 6 et 3 cm de fantôme afin de se rapprocher au mieux des conditions d’irradiation

cliniques.

Une courbe de fraction de survie en fonction de la dose d’irradiation employée est obtenue à

par-tir du nombre de clones. Pour cela lePlating efficiencyou PE est d’abord calculé d’après la formule :

P E= _{nombre de colonies ensemencées}^{nombre de colonies comptées}

Puis, la fraction de survie ou FS est calculée d’après :

F S= PEn Gy

PE0 Gy

Où :

PEn Gy : lePlating efficiencyà la dose d’irradiationn,

PE0 Gy : lePlating efficiencyà 0 Gy.

Ces données expérimentales ont ensuite été fittées par un modèle linéaire quadratique utilisé en

radiothérapie pour modéliser l’effet d’un rayonnement ionisant sur un type tumoral. L’équation du

modèle est la suivante :

F S=exp−(αD+βD

²

)

Où :

F S: la fraction de survie,

D: la dose en Gy,

αetβ : les paramètres du modèle.

L’équation du modèle fournit des paramètresαetβ qui définissent mathématiquement l’allure

de la courbe de survie.

La comparaison des effets couplés RX-nanoparticules a été faite suivant la notion de DMF (Dose

Modifying Factor) qui en radiobiologie permet de montrer l’effet radio-sensibilisant ou radio-protecteur

d’une molécule par rapport au rayonnement seul.

DM F = _{Dose pour produire le même effet sans nanoparticule}^{Dose pour produire un effet avec une nanoparticule}

Dans le document Thérapies par rayonnements appliquées au cas du glioblastome : Intérêt du suivi par spectroscopie et imagerie de diffusion par résonance magnétique. Vers une thérapie bimodale. (Page 182-185)