Culture cellulaire

Matériel et Méthodes

Sommaire

2.1 Caractérisation photophysique des nanoparticules terbium-porphyrine . . 163

2.1.1 Caractéristiques générales des nanoparticules . . . 163

2.1.2 Caractérisation photophysique et physico-chimique des nanoparticules 164

2.2 Culture cellulaire . . . 165

2.3 Mesure de Cytotoxicité . . . 166

2.4 Mesure de l’incorporation cellulaire . . . 166

2.5 Capacité clonogénique . . . 167

2.6 Détection des espèces réactives de l’oxygène . . . 170

2.1 Caractérisation photophysique des nanoparticules terbium-porphyrine

2.1.1 Caractéristiques générales des nanoparticules

Les nanoparticules hybrides multifonctionnelles étudiées ont été synthétisées par Albert

Moussa-ron, sous la direction de François Lux et Olivier Tillement, à l’UMR 5306, CNRS, Université Claude

Bernard, Lyon, Institut Lumière Matière. Elles sont constituées :

1. d’un squelette de fonctionnalisation en polysiloxane sur lequel sont greffés de façon covalente

les parties suivantes :

2. des atomes de terbium Tb(III) chelatés par un dérivé du DOTA (acide 1,4,7,10-tétra-azacyclododécane

- 1,4,7,10-tétra-acétique) constituant la partie luminescente de la nanoparticule, et ayant des

propriétés d’agent de contraste en IRM,

3. le photosensibilisateur, qui est ici une porphyrine 5-(4-carboxyphényl)-10,15,20-triphénylporphyrine)

(lot 074aGA014, Porphychem, Dijon, France) que nous nommerons P1 sous sa forme libre.

Elles sont plus précisément constituées de 7 à 10 molécules de terbium, greffées à 0,2 P1/Tb. Les

nanoparticules contrôle sans photosensibilisateur sont appelées "Tb", celles greffées avec de la P1

"Tb@P1", la porphyrine seule "P1" et le mélange nanoparticule de terbium non greffées/porphyrine

"Tb+P1". Les concentrations respectives de Tb et de P1 dans le mélange Tb+P1 ont été calculées

d’après le taux de greffage des Tb@P1.

2.1.2 Caractérisation photophysique et physico-chimique des nanoparticules

Le taux de greffage de la P1 sur les nanoparticules de Tb a été déterminé par une gamme étalon

en absorption de la porphyrine. Pour pouvoir comparer l’échantillon (Tb@P1) à la référence (P1),

la solution mère de porphyrine a été préparée dans du DMSO à 2 mM pour la solubilisation, puis

diluée à 200µM dans de l’eau milliQ afin d’être dans le même milieu que l’échantillon. Une dilution

en cascade contenant 5 points allant de 100 à 5µM a ensuite été réalisée pour effectuer la gamme

étalon à 519 et 649 nm (pics correspondants respectivement à la bande QIV et QI). L’échantillon a

lui aussi été dilué en cascade afin de vérifier en plusieurs points la proportionnalité de la gamme.

Les spectres d’absorption, de fluorescence, de rendement quantique en oxygène singulet et de

fluorescence en temps décalé ont été réalisé au sein du LRGP (Laboratoire Réactions et Génie des

Procédés), UMR 7274 CNRS, Université de Lorraine, avec l’aide de Rima Chouikrat et Philippe

Ar-noux.

Le diamètre hydrodynamique et le potentiel zeta ont été réalisés au sein du LIBio (Laboratoire

d’In-génierie des BIOmolécules) Université de Lorraine par Jordane Jasniewski.

Tous les spectres ont été mesurés en utilisant des cuves quartz à 4 faces.

Les spectres d’absorption et de fluorescence des nanoparticules ont été réalisés dans l’eau

deuté-rée en utilisant respectivement, un spectrophotomètre et un spectrofluorimètre (Perkin Elmer,

Cour-taboeuf, France). L’excitation est assurée par une lampe Xénon à arc basse pression. Les rendements

de fluorescence (Φ

f luo

) sont déterminés par rapport à une solution référence, la

tetraphénylporphy-rine (TPP) diluée dans du toluène. Les solutions de référence (TPP) et de nanoparticules sont diluées

jusqu’à ce que l’absorption de la bande de Soret à 419 nm soit comprise entre 0,10 et 0,25. Les

ren-dements de fluorescence sont calculés selon la formule suivante :

Φ

f luo

=Φ

f luo(r f)

×

_{Ir f}^I

×

^Ar f A

×

_nⁿ_{r f}

Où :

Φ

f luo

etΦ

f luo(r f)

^{: le rendement de fluorescence de l’échantillon dans l’eau deutérée et de la}

réfé-rence dans le toluène, respectivement,

I et I

_{r f}

: les aires sous les spectres de fluorescence entre 600 et 750 nm de l’échantillon et de la

référence, respectivement,

AetA

_{r f}

: l’absorption à 419 nm de l’échantillon et de la référence, respectivement et

netn

_{r f}

: l’indice de réfraction de l’eau deutérée et du toluène, respectivement.

Les rendements quantiques d’oxygène singulet (Φ

_∆

) de l’échantillon sont déterminés dans l’eau

deutérée à l’aide d’un spectrofluorimètre Fluorolog-3 (Horiba Jobin Yvon, Longjumeau, France). Les

échantillons sont excités à l’aide d’une lampe Xénon à arc placée sur un SPEX 1680 possédant un

double monochromateur de 0,22µm. La luminescence de l’oxygène singulet, suite à une excitation

à 419 nm, est mesurée à 1270 nm à l’aide d’un monochromateur double réseau PTI S/N 1565 et

d’un détecteur IR InGaAs, refroidi à l’azote liquide (DSS-16A020L Electro Optical Systems INC). Les

rendements quantiques d’oxygène singulet sont déterminés par rapport à une solution de référence

de rose bengale diluée dans l’eau deutérée, suivant la formule suivante :

Φ

_∆

=Φ

_∆(r f)

×

_{Ir f}^I

×

^Ar f A

2.2. Culture cellulaire

Φ

_∆

etΦ

_δ(r f)

^{: les rendements quantiques de formation d’oxygène singulet de l’échantillon et de la}

référence, respectivement,

AetA

_{r f}

: l’absorption à 419 nm de l’échantillon et de la référence (rose bengale), respectivement,

I etI

_{r f}

: l’intensité du pic de luminescence à 1270 nm de l’échantillon et de la référence,

respecti-vement.

Les spectres de fluorescence en temps décalée ont été acquis à l’aide d’un spectrofluorimètre

Fluorolog FL3-22 (Jobin-Yvon Horiba, Longjumeau, France) équipé d’une lampe Xénon à flash, un

compartiment thermostaté (25°C), un photomultiplicateur UV-visible R928 (Hamamatsu, Japon). Le

faisceau d’excitation est diffracté par un monochromateur SPEX double réseau (1200 fentes/nm

pro-jeté à 500 nm). Tous les spectres ont été mesuré sur des cuves en quartz 4 faces. Tous les acquisitions

en émission ont bénéficié de la correction de la lampe et du photomultiplicateur et ont été comparées

pour une même valeur d’absorption.

Les échantillons de nanoparticules,Tb,P1,Tb+P1etTb@P1ont été préparé dans de l’eau milliQ

filtrée 1 heure avant l’expérimentation. Après acquisition du spectre d’émission du Tb nous avons

choisi de régler l’absorption des échantillons à 542 nm à une valeur de 0,114 pour la P1, Tb@P1 et

0,121 pour Tb+ P1 ( car c’est à cette valeur que le spectre d’émission du terbium chevauche celui

de la porphyrine). L’absorption de l’échantillon Tb a été réglée à 294 nm à une valeur de 0,485.

La fluorescence en temps décalé à ensuite été mesurée pour chaque échantillon avec les réglages

suivants :

– Excitation : 294 nm

– Emission : 600 - 800 nm

– Fente : 2

– Temps du Flash : 41 ms

– Délai après Flash : 0,010 ms

Les spectres acquis dans ces conditions ont ensuite été corrigés par rapport à leur valeur

d’ab-sorption à 294 nm pour pouvoir être comparés.

Les mesures de taille par diffusion dynamique de la lumière sont réalisées avec un Zetasizer

Na-noZS (Malvern) équipé d’un laser He-Ne à 633 nm. Une filtration des échantillons sur une membrane

en cellulose à porosité de 0,2µm a été effectuée avant chaque mesure. Le potentiel Zeta des

nano-particules a été déterminé sur le même appareillage. Avant mesure, les échantillons ont été dispersés

dans une solution saline de NaCl à 0,01 mol/l et ajusté à pH 7,4.

2.2 Culture cellulaire

Les cellules U87 ont été obtenues de l’ATCC (American Type Culture collection, Manassas, E.U.)

et proviennent d’une tumeur cérébrale humaine de grade IV d’après la classification O.M.S type

glioblastome, astrocytome. Ce sont des cellules adérentes, maintenues en culture dans du milieu

de culture DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Gibco®, invitrogen™, Carlsbad, E.U.)

sup-plémenté en sérum de veau fœtal décomsup-plémenté (10%, PAN™ biotech GmbH), en antibiotiques

(pénicilline/streptavidine 1%, Gibco®, invitrogen™), en pyruvate de sodium (1,25%), acides

ami-nés essentiels (1%), acides amiami-nés non essentiels (0,5%), vitamines (0,4%), L-glutamine, L-sérine,

L-asparagine (1%) sous conditions standards : 5% CO2, 37°C, 95% d’humidité.

Dans le document Thérapies par rayonnements appliquées au cas du glioblastome : Intérêt du suivi par spectroscopie et imagerie de diffusion par résonance magnétique. Vers une thérapie bimodale. (Page 178-181)